Niveles anormales de anticuerpos contra sarampión, paperas, rubéola y enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central (SNC) en niños con autismo

Niveles anormales de anticuerpos contra sarampión, paperas, rubéola y enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central (SNC) en niños con autismo

Revista de ciencia biométrica
Singh VK, Lin SX, Newell E, Nelson C.
2002


Resumen

Enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central (SNC), especialmente contra proteína básica de mielina (MBP), podría tener un papel causal en el autismo, un trastorno del desarrollo neurológico. Dado que muchos niños autistas tienen altos niveles de anticuerpos contra el sarampión, realizamos un estudio serológico de sarampión, paperas, rubéola y autoanticuerpos del sistema nervioso central. Utilizando muestras de suero de 125 niños autistas y 92 muestras de control, los anticuerpos se analizaron mediante la prueba ELISA1 y el análisis de inmunotransferencia (inmunofijación) 2. Las pruebas ELISA demostraron un aumento significativo en los niveles de anticuerpos MPR en niños autistas. Los análisis de inmunofijación revelaron la presencia de un anticuerpo MPR inusual en 75 de 125 sueros de niños autistas (60%) y ninguno en el grupo de control. Este anticuerpo fue específico contra la proteína 73-75 kD de MPR. Esta proteína, analizada con anticuerpos monoclonales, era inmunopositiva contra la proteína H del sarampión, llamada hemaglutinina3, pero no contra las nucleoproteínas del sarampión y contra las proteínas virales de la rubéola y las paperas. Por lo tanto, el anticuerpo MPR en el suero de niños autistas identifica la proteína H del sarampión, que es específica de la subunidad de la vacuna. Además, más del 90% de los sueros de niños autistas positivos para anticuerpos contra MPR también fueron positivos para autoanticuerpos contra la proteína de mielina básica (MBP), lo que sugiere una fuerte asociación entre MPR y enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central en el autismo. Esta evidencia implica que una respuesta inapropiada a la vacuna MPR, especialmente en el componente de sarampión, podría estar relacionada con la patogénesis del autismo. 


Introducción

El autismo es un trastorno del desarrollo del sistema nervioso central de desarrollo temprano, cuya etiología y patogénesis son desconocidas. El trastorno causa déficits severos de las funciones mentales superiores más altas como la interacción social, el lenguaje, la comunicación, la imaginación y la capacidad cognitiva. Aunque el autismo afecta a más de medio millón de estadounidenses y aún más en todo el mundo, se sabe poco sobre la etiología y la patogénesis del trastorno. Las teorías contemporáneas incluyen factores genéticos, inmunológicos, ambientales y neurológicos, así como otros factores no identificados. A partir de la regulación inmune defectuosa en niños autistas [10, 12, 16, 21, 23 [, se ha prestado atención al mecanismo autoinmune de la patogénesis del autismo [14-17, 19, 20]. Dado que las enfermedades autoinmunes son generalmente sospechosas de ser desencadenadas por virus, recientemente se han llevado a cabo investigaciones serológicas para la detección de virus en el autismo [15, 17]. Se descubrió que muchos niños con autismo tenían altos niveles de anticuerpos contra el virus del sarampión (VM), pero no contra el virus del herpes humano tipo 6 (HHV-6), el citomegalovirus o el virus de la rubéola (RV) . Además, el alto nivel de anticuerpos contra el sarampión estaba fuertemente asociado con la presencia de autoanticuerpos cerebrales, lo que nos llevó a postular una asociación patogénica entre el virus del sarampión y la autoinmunidad presente en el autismo [15, 17]. Para determinar con más detalle el origen de esta infección de sarampión, investigamos la posibilidad de una respuesta de anticuerpos excesiva o inapropiada a la vacuna MPR en relación con enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central (SNC). Como se describe aquí, varios niños con autismo tienen niveles inusuales de anticuerpos MPR y muestran una asociación temporal con autoanticuerpos contra la proteína de mielina básica (MBP) que se ha utilizado como un marcador de autoinmunidad del SNC en el autismo. 


Métodos y materiales

Realizamos un estudio de laboratorio sobre anticuerpos MPR y autoanticuerpos MBP en sueros de niños autistas y de un grupo de control. Dado que este estudio fue una extensión de nuestra investigación en curso, utilizamos muestras de suero previamente recolectadas y criopreservadas a una temperatura de -20 ° C [14-17]. En el estudio participaron un total de 217 niños: 125 niños autistas (de entre 4 y 10 años) y 92 en el grupo de control (de los cuales 58 niños normales entre 5 y 13 años, 6 hermanos o hermanas normales de 6 a 9 años y 28 niños de entre 4 y 12 años que tenían otros trastornos de conducta que no estaban dentro del espectro autista). Los resultados del análisis inmunológico mostraron que todos los niños recibieron una vacuna contra MPR, pero ninguno había tenido casos de fiebre de la piel o infección por virus salvaje. El diagnóstico clínico de autismo se había realizado esencialmente de acuerdo con los estándares DSM-IIIR, establecidos por la Asociación Americana de Psiquiatras, Washington, DC, EE. UU., Como se describió anteriormente [14-17]. En el estudio participaron solo niños con un diagnóstico determinado de autismo. El Comité de Ética ha revisado y aprobado nuestro protocolo de investigación que incluía el uso de muestras de suero humano solamente. Durante la recolección de muestras de sangre o durante al menos dos semanas antes de la recolección, ninguno de los pacientes autistas o el grupo de control tuvo que tomar medicamentos como antipsicóticos o neurolépticos. Los anticuerpos MPR se investigaron inicialmente mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (prueba ELISA) para la valoración del suero, pero posteriormente se investigaron mediante análisis de inmunofijación para detectar el suero. En ambos métodos de análisis, se utilizó la vacuna MPR-II (Merck, West Point, Pa., EE. UU.) Como antígeno. Los autoanticuerpos contra la proteína de mielina básica (MBP) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EE. UU.) Han sido investigados mediante análisis de inmunofijación como rutina en nuestro laboratorio. Todas las pruebas inmunológicas se realizaron internamente (dentro del laboratorio), por razones relacionadas simplemente con la naturaleza particular del estudio y porque en este momento no están disponibles en ninguna fuente comercial. 

La búsqueda de anticuerpos contra MPR por ELISA se realizó sobre la base de investigaciones previas realizadas por nosotros utilizando este método [18]. Brevemente, los micropocillos de una placa de microvaloración Costar (Corning, Corning, NY, EE. UU.) Se recubrieron con antígeno MPR disuelto en una solución salina tampón fosfato4 en el ph 7,4. La placa se lavó tres veces con tampón de interpolación PBF al 0,05%. Se pipetearon 100 µl / pocillo de tampón de fosfato salino en los micropocillos blancos.5 o suero humano prediluido en cuatro diluciones en los micropocillos de prueba. La placa se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Después de tres lavados con tampón PBF-tween, se pipetearon 100 µl / pocillo de anti-IgG humana de cabra conjugada en fosfatasa alcalina y diluida a 1: 500 (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). La placa se incubó a temperatura ambiente durante una hora y luego se lavó de nuevo tres veces. Posteriormente, se añadió una cantidad de 100 µl / pocillo de una solución de sustrato (1 mg / ml de p-nitrofenilfosfato en 50 mM de tampón de bicarbonato de sodio, pH 9.6, que contenía 1 mM de cloruro de magnesio). La reacción de color se detuvo con 20 µl / pocillo de NaOH 1 N y la placa se leyó a 405 nm usando un modelo de Microplate Reader 3550 (Bio-Rad, Richmond, CA, EE. UU.). Después de restar el blanco, las lecturas de absorbancia se convirtieron en unidades arbitrarias de EIA, Inmunoensayo enzimático: Inmunoensayo enzimático (0.01 DO = 1 unidad EIA).

El análisis de inmunofijación se realizó inicialmente según el método publicado por nosotros (17-20), utilizando MPR o MBP (proteína básica principal) como antígenos de detección y proteínas estándar pre-coloreadas (pre-coloreadas) (Bio -RAD). En resumen, las proteínas se separaron en una solución de gel lista para usar (Bio-Rad) al 12% por electroforesis usando gel de poliacrilamida (PAGE) y dodecil sulfato de sodio (SDS)6. Luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando la técnica de doble sándwich, seguido de bloqueo con albúmina de suero bovino al 1% en tampón salino tris (TBS: solución salina tamponada con Tris). Las membranas se secaron al aire y se colocaron a temperatura ambiente. 

Para las pruebas inmunológicas, se incubaron pequeñas transferencias de 3-4 mm de diámetro durante una hora con suero adecuadamente diluido de pacientes autistas o de control. Después de cuatro lavados con TBST (tampón de solución salina tris que contiene Tween-0,05 al 20%), las transferencias se incubaron durante una hora con inmunoglobulinas IgG antihumanas de cabra polivalentes conjugadas en fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina conjugada con cabra antihumana polivalente inmunoglobulinas) (Sigma). Después de cuatro lavados con TBST, las transferencias se desarrollaron en una solución de sustrato de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de sustrato AP (fosfatasa alcalina) (Bio-Rad). La reacción se consideró positiva solo si se mostraba la banda azul-violeta. En algunos experimentos, se encontró la presencia de proteínas virales en las transferencias de MPR a través de anticuerpos monoclonales contra la hemaglutinina MV (HA), la nucleoproteína MV-NP, RV o MuV (Chemicon International, Temecula, California, EE. UU.), Seguido de inmunosearch a través de cabra anti-mouse-IgG fosfatasa alcalina; Para todas las demás pruebas, se replicaron las condiciones anteriores. Para determinar el peso molecular, realizamos simultáneamente proteínas estándar SDSPAGE pre-coloreadas (Bio-Rad) con miosina incluida (207 kD), ß-galactosidasa (121 kD), albúmina de suero bovino (81 kD), ovoalbúmina (51.2 kD ), dióxido de carbono (33.6 kD), inhibidor de rizina de soja (28.6 kD), lisozima (21.1 kD) y aprotinina (7.5 kD).


Resultados

En primer lugar, es importante subrayar el hecho de que hemos elegido MPR como antígeno para el cribado simplemente porque es el antígeno inmunizante cuando los niños son vacunados con MPR. Por lo tanto, los anticuerpos contra MPR serán una medida exacta de la conversión del suero para esta vacuna trivalente o polivalente, en lugar de los anticuerpos contra el sarampión viral, las paperas o las proteínas de la rubéola que se usan individualmente para medir la serología viral en la práctica habitual. Inicialmente, para estudiar los efectos del suero diluido, se midió el nivel de anticuerpos MPR mediante pruebas ELISA en suero de 24 niños autistas, 14 niños normales y otros 16 niños con problemas más allá del autismo. El resultado de la prueba ELISA sobre los niveles de anticuerpos MPR en suero se resume en la Figura 1. 

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Detección de anticuerpos MPR mediante prueba ELISA. Los niveles de anticuerpos MPR se muestran de acuerdo con la dilución del suero para niños autistas (n = 24, círculos en la línea superior), niños normales (n = 14, cuadrados en la línea central) y niños con Otros problemas de salud (n = 16, triángulos, en la línea inferior). Estadísticamente, según lo evaluado por la prueba del estudiante, el nivel de anticuerpos MPR es mucho mayor en niños autistas. Los datos se expresan por error estándar ± (Error estándar SE).

Los niños autistas, cuyo suero se probó en varias diluciones, tenían un nivel significativamente más alto de anticuerpos MPR que los niños normales y aquellos con otros problemas. El pico más alto (más de siete veces) se observó a una dilución 1:50 de suero autista. El método ELISA se usó principalmente para determinar una dilución apropiada del suero, que luego se evaluó a 1:50. Posteriormente, todos los sueros se analizaron en esta dilución a través del análisis de inmunofijación, ya que este método permite el análisis de las proteínas a las que se unen los anticuerpos, que era el objetivo principal del presente estudio.

El análisis de inmunofijación de los 217 sueros reveló que 75 de 125 sueros autistas, contra ninguno de los 92 sueros de control, tenían anticuerpos contra MPR y MBP. Como se muestra en la Figura 2, los sueros autistas tuvieron una reacción inmunopositiva a una banda de proteína de 73-75 kD en la transferencia MPR (fig. 2, línea B) mientras que el suero de control no tuvo esta reacción (fig. 2, línea A); ninguna otra banda de proteína fue inmunopositiva en este análisis. Además, la misma banda de proteína en las transferencias de MPR tuvo una reacción inmunopositiva a los anticuerpos monoclonales MV-HA (figura 3, línea izquierda) pero no a los anticuerpos monoclonales MV-NP (figura 3, línea derecha). Las transferencias de MPR fueron inmunonegativas para los anticuerpos monoclonales RV o MuV (Figura 4). En línea con estudios previos [5, 15, 19, 20], los sueros autistas contenían autoanticuerpos MBP de 18,5 a 20 kD (figura 2, línea D), que el peso molecular del cerebro bovino MBP utilizó en el presente estudio. Los sueros de control fueron negativos para autoanticuerpos MBP (Figura 2, línea C).

Según los análisis de inmunofijación, encontramos que 75 de 125 (60%) de los niños autistas fueron positivos para anticuerpos MPR, mientras que 70 de 125 (56%) niños autistas tenían autoanticuerpos MBP (fig. 5). Ninguno de estos dos tipos de anticuerpos se detectó en el grupo control (niños sanos o con otros tipos de enfermedad). Además, de acuerdo con los datos de nuestros análisis de inmunofijación, el grupo de niños autistas encontró una correlación interesante entre los anticuerpos MPR y los autoanticuerpos MBP, es decir, más del 90% de los sueros autistas positivos a los anticuerpos MPR también fueron positivos a los autoanticuerpos MBP (fig. 5 ). Esta correlación estuvo ausente en el grupo control ya que los niños en este grupo fueron negativos tanto para los anticuerpos MPR como para los autoanticuerpos MBP.

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Higo. 2. Inmunoblots representativos de anticuerpos MPR y autoanticuerpos MBP. Como se describe en el texto, las proteínas en los puntos MPR y MBP se incubaron con suero autista o de control y se analizaron con inmunoglobulinas polivalentes de cabra antihumanas conjugadas con fosfatasa alcalina. Tenga en cuenta que los sueros autistas (carriles B y D), pero no los sueros de control (carriles A y C), mostraron reacciones positivas de anticuerpos con una proteína de 73 a 75 kD en la tinción MPR y una proteína 18,5, 20 a 12 kD en el lugar MBP, respectivamente. En el gel de acrilamida al 17,5%, la banda de proteína MPR (Rf = 16,4 mm) migró un poco más rápido que la albúmina de suero bovino (Rf = 161 mm) en comparación con otros estándares de proteínas preenvasados ​​(Cat. No. 0318-XNUMX, Bio-Rad). 

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Higo. 3. Las inmunotransferencias MPR representativas reaccionaron con anticuerpos monoclonales contra proteínas MV. Para este propósito, las manchas de MPR se incubaron por separado con dos diluciones (1: 100 y 1:50) de anticuerpos monoclonales MV-HA o anticuerpos monoclonales MV-NP y se detectaron con fosfatasa alcalina anti-IgG de ratón de cabra. Tenga en cuenta que el anticuerpo monoclonal MV-HA (carriles A y B), pero no el anticuerpo monoclonal MV-NP (carriles C y D), mostró una reacción inmunopositiva con una banda de 73 a 75 kD de la tinción MPR. 

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Higo. 4. Las inmunoblots representativas de MPR reaccionaron con anticuerpos monoclonales contra RV o MuV. Los puntos MPR de 4 sesiones SDSPAGE separadas se incubaron con anticuerpos monoclonales (dilución 1: 100) en RV o MuV y se detectaron con fosfatasa alcalina IgG anti-ratón de cabra. Tenga en cuenta que los puntos MPR fueron negativos en estos inmunoensayos.

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Higo. 5. Distribución de anticuerpos MPR y MBP en niños autistas y de control. Después de la detección de anticuerpos mediante inmunotransferencia, se calculó el porcentaje de sueros positivos para anticuerpos en cada grupo de estudio. Esto fue rastreado contra la fuente de antígeno probada. Tenga en cuenta que solo el grupo autista mostró reacciones positivas (barras verticales), pero el grupo de control que incluía niños normales (cuadro base 1), hermanos normales (cuadro base 2) y niños con otras enfermedades (cuadro base 3) Fue negativo.


Hilo

Varios estudios en todo el mundo han sugerido que los factores inmunes como la autoinmunidad pueden desempeñar un papel fundamental en la patogénesis del autismo [10, 12, 14-17, 19, 20]. Hay evidencia de factores de susceptibilidad inmunogenética [24] y agrupación familiar de enfermedades autoinmunes en familias con niños autistas [4]. Los niños autistas tienen numerosas anormalidades inmunes: aumento de IgG3 en suero [16], disminución de IgA en suero [7,12], disminución en el número y funciones de linfocitos, en particular células T auxiliares (CD4 +) y células asesinas naturales (NK) [10, 12, 21, 23] y el aumento de los niveles plasmáticos de citocinas autoinmunes específicas como la interleucina-2, la interleucina-12 y el interferón-gamma [4]. El aumento en la frecuencia de algunos factores inmunogenéticos (alelo nulo C4B, haplotipo extendido B44-SC30-DR4 y región HLA-DRb1 hipervariable) también se ha demostrado en algunos niños con autismo [24]. Muchos niños autistas tienen autoanticuerpos específicos de órganos, en particular autoanticuerpos contra la proteína MBP derivada de mielina del cerebro [15, 17, 19, 20]. Además, un número considerable de niños autistas muestran mejoras significativas en las características autistas cuando son tratados con terapia inmunológica como el autoantígeno oral [15], la inmunoglobulina intravenosa [7] o el factor de transferencia [5]. Colectivamente, estas anormalidades inmunes y / o terapias inmunes son consistentes con una base autoinmune de patogénesis en el autismo.

Los virus se asocian comúnmente con enfermedades autoinmunes, a pesar de la falta de evidencia experimental. Se desconoce el mecanismo desencadenante de la autoinmunidad en el autismo, pero se han descrito asociaciones virales [2, 8]. Los niños autistas tienen un valor significativamente mayor que los niveles normales de anticuerpos contra el sarampión, pero no los anticuerpos contra el HHV-6, la rubéola o el citomegalovirus [15, 17]. El aumento específico en el nivel de anticuerpos contra el sarampión también fue consistente con una asociación serológica entre MV y autoinmunidad en el autismo, lo que nos llevó a postular un vínculo etiológico entre MV y autismo [15, 17]. Como se informó aquí, se ha encontrado un aumento significativo en el nivel de anticuerpos MPR en niños autistas. Además, el anticuerpo MPR mostró una reacción inmunopositiva a una proteína de MPR de 73 a 75 kD en el 60% de los niños autistas en el estudio. Este fue un resultado importante porque el peso molecular de la proteína MPR que reaccionó positivamente a los anticuerpos MPR se parecía al peso molecular de una proteína de sarampión conocida como antígeno HA. De hecho, la banda MPR contenía el antígeno MV-HA ya que era inmunopositivo para los anticuerpos monoclonales contra MV-HA, pero no para los anticuerpos monoclonales contra MV-NP. En datos preliminares no incluidos aquí, recientemente descubrimos que el anticuerpo monoclonal MV-HA pero no el anticuerpo monoclonal MVNP ha bloqueado casi por completo la unión del anticuerpo de suero positivo para anticuerpos (MPR) a la banda de proteína MPR en la inmunotransferencia. Por lo tanto, estos estudios indirectos sugieren que los anticuerpos MPR en sueros autistas tienen más probabilidades de estar dirigidos hacia el antígeno HA que MV. Además, la banda de MPR de 73 a 75 kD no contenía RV o MuV ya que esta banda era inmunonegativa para anticuerpos monoclonales para cada uno de estos dos virus. En comparación con los niños autistas, los niños control tenían niveles bajos de anticuerpos MMR que eran inmunonegativos para el antígeno MV-HA derivado de MMR. Por lo tanto, parece plausible que los niños autistas produjeran una respuesta de anticuerpos inapropiada o anormal al MDR que se dirigió contra el antígeno MV-HA. Sin lugar a dudas, se necesita más investigación sobre este tema, pero estamos tentados a especular que la inmunorregulación defectuosa o los factores inmunogenéticos pueden determinar por qué solo los niños autistas producen estos anticuerpos anormales a la proteína derivada de MPR (73-75 kD) que parece ser el MV HA antígeno. Alternativamente, la diferencia entre niños autistas y de control puede deberse a una modificación estructural (o mutación) del determinante antigénico reconocido por los anticuerpos MPR. La inmunización con vacunas es la mejor medida preventiva contra las infecciones mortales disponibles hoy para la humanidad. Dado que las vacunas se administran a sujetos sanos, casi exclusivamente a niños, la seguridad de las vacunas debe ser tan absoluta como sea humanamente posible. Aunque la ecuación riesgo-beneficio favorece fuertemente la vacunación, existen algunos efectos secundarios graves, aunque extremadamente raros, que merecen atención científica. Por ejemplo, la meningitis aséptica [6] y la ataxia cerebelosa [11] se han descrito en niños inmunizados con MPR. Sin embargo, la base de cómo las vacunas reaccionan negativamente en algunos casos sigue siendo prácticamente desconocida. Es completamente posible que las vacunas en una pequeña población de niños genéticamente predispuestos puedan reaccionar de manera inapropiada, simplemente debido a su sistema inmune inmaduro u otros factores de riesgo desconocidos como inmunodeficiencias, alergias, toxinas químicas o estrés psicológico crónico [3]. .

En los últimos años, el tema de la inmunización-autoinmunidad ha llamado la atención del público. Esto probablemente se deba al hecho de que las enfermedades autoinmunes son las manifestaciones más comunes de las vacunas [1, 13]. MDR ha sido insinuado como culpable de problemas gastrointestinales en algunos niños con características autistas [22]. Aproximadamente la mitad de los padres con hijos autistas informaron una regresión autista después de la vacuna MPR [17]. Además, se encontró una asociación serológica de MV con autoinmunidad en niños autistas que no tenían infección de sarampión de tipo salvaje pero tenían inmunización MPR [17]. Y, como se describe aquí, los niños autistas mostraron una correlación serológica entre MPR y autoinmunidad cerebral, es decir, más del 90% de los sueros autistas positivos para anticuerpos MPR también tenían autoanticuerpos anti-MBP cerebrales. Esta es una observación bastante intrigante a favor de una conexión entre la infección de sarampión atípica y el autismo; La infección atípica generalmente se refiere a la infección que ocurre en ausencia de una erupción. Recientemente se ha descrito una infección atípica de sarampión en ausencia de erupción cutánea y síntomas neurológicos inusuales que sugieren la existencia de una variante de MV en niños y adultos [9]. A la luz de estos nuevos hallazgos, sugerimos que un porcentaje considerable de casos de autismo puede ser el resultado de una infección de sarampión atípica que no produce erupciones cutáneas pero causa síntomas neurológicos en algunos niños. La fuente de este virus podría ser una variante MV o podría ser la vacuna MPR. Científicamente, por lo tanto, es instructivo considerar ambas posibilidades y descubrirlas a través de la investigación experimental. Creemos que este es un problema de salud pública extremadamente importante, simplemente porque algunos científicos nos han advertido recientemente sobre la aparición de un MV mutante que causa enfermedades fatales en humanos [9]. Si este es el caso, se necesitarán nuevas estrategias de vacunación para combatir la infección por sarampión mutante. Si bien se necesita más investigación para establecer un papel patognomónico para MPR / MV, actualmente estamos explorando el papel de la autoinmunidad inducida por virus y nuestra futura investigación tiene como objetivo caracterizar la base molecular de la inmunidad celular y humoral a los antígenos virales en niños con autismo.


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fuente: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12145534


Traducción de Nicoletta Protti y Claudio Andreini Di Vita, Cliva Tuscany