Priorix Tetra genoma humano y línea celular MRC-5 - estudio comparativo

Priorix Tetra genoma humano y línea celular MRC-5 - estudio comparativo

Breve presentación de los resultados.

Hoy presentamos un estudio en profundidad adicional y muy importante sobre la secuenciación genómica de la línea celular que encontramos dentro de la vacuna cuadrivalente MPRV (sarampión, rubéola, paperas y varicela) Priorix Tetra®, y la de la línea celular MRC-5 ( la declaradamente utilizada en el desarrollo de la vacuna en sí).

Resumiendo los informes publicados anteriores:

  1. Primero, demostramos que la cantidad de ADN presente en la vacuna mencionada anteriormente está muy por encima del umbral permitido;
  2. En segundo lugar, verificamos que la línea celular es en realidad el MRC-5 declarado; 2
  3. Por último, llevamos a cabo la secuenciación del genoma de la línea celular extraída directamente de la vacuna, destacando las mutaciones importantes que abren la posibilidad de riesgos graves para la salud al usar esta vacuna.

Lo que presentamos aquí es precisamente un trabajo comparativo entre los dos genomas: el que realmente encontramos dentro de la vacuna y el que adquirimos del banco internacional de líneas celulares como MRC-5.

El resultado es que las dos líneas muestran diferencias importantes desde el punto de vista de la estabilidad genética. En particular, el genoma de la vacuna se modifica significativamente en comparación con la línea celular registrada en 1966.

Eso significa que los productores, en este caso de Priorix Tetra®, han comprado la línea celular en condiciones óptimas desde el punto de vista de la estabilidad genética y, mediante el uso continuo a lo largo del tiempo para fines de producción, han comercializado vacunas que contienen progresivamente más y más material genético humano modificado, que es peligroso para la salud de los vacunados mismos.

Dado que las agencias reguladoras no requieren un monitoreo periódico de la estabilidad genética de las líneas fetales y ni siquiera establecen un umbral mínimo de seguridad, podemos deducir que no se ha cumplido un requisito fundamental para la calidad y seguridad de las vacunas obtenidas de las líneas celulares humanas. hace algún tiempo, es decir, la necesidad de verificar que no desarrollen mutaciones y reordenamientos potencialmente peligrosos y garantizar la eliminación del procesamiento de residuos de material genético, si están presentes.

No es nuestra responsabilidad identificar qué parte del proceso de producción o conservación podría afectar la calidad y seguridad del producto, pero lo que podemos confirmar hoy, al publicar este informe, es la urgencia de llevar a cabo un examen en profundidad de los resultados de nuestros análisis. hemos estado notificando en los últimos dos años, enfocándonos en el producto terminado, vendido y administrado y no solo en los "ingredientes" autorizados únicos.

Quisiéramos recordar una vez más que estos productos son parte del calendario de vacunación italiano y actualmente son obligatorios para la población pediátrica en nuestro país, así como en otros países europeos y en general en todo el mundo.

Las agencias reguladoras tienen una gran responsabilidad con respecto a la seguridad, que actualmente se está expresando pero, en la práctica, y hasta donde muestran nuestros análisis, no se puede garantizar y, de hecho, claramente no se garantiza.


Visualización circular de genomas (diagrama de circos)

A continuación se muestra una representación gráfica de los dos genomas llamada 'trama de circos'.

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Explicación de los diversos círculos concéntricos.

  1. El círculo externo (el primer círculo) es el número de cromosoma.
  2. El segundo anillo (azul) representa la cobertura de las lecturas de estilo de histograma. Cada histograma es la cobertura promedio de un área de 0.5 Mbp.
  3. El tercer anillo (negro) representa la densidad de los INDEL en el estilo de 'gráfico de dispersión'. Cada punto negro se calcula como el número de INDEL (pequeñas inserciones / eliminaciones) en un rango de 1 Mbp.
  4. El cuarto anillo (verde) representa la densidad snp en el estilo de 'gráfico de dispersión'. Cada punto verde se calcula como el número de SNP (variantes de un solo nucleótido) en un rango de 1 Mbp.
  5. El quinto anillo representa la proporción de SNP en el estilo de histograma de homocigosidad (naranja) y heterocigosidad (gris). Cada histograma se calcula a partir de una región de 1 Mbp.
  6. El sexto anillo representa la inferencia de CNV (Variantes en número de copias). Rojo significa ganancia de piezas de ADN y verde significa pérdida.
  7. El anillo más central representa la inferencia de SV (variantes estructurales) en las áreas hexagonales y de empalme. TRA (naranja, translocaciones), INS (verde, inserciones), DEL (eliminaciones, gris), DUP (duplicaciones, rosa) e INV (inversiones, azul).

Conclusión

Los dos genomas muestran diferencias importantes. En particular, el genoma de la vacuna parece estar seriamente mutado en comparación con la línea celular depositada en 1966. Hay que decir que no hemos tenido la posibilidad de secuenciar la línea celular utilizada por GlaxoSmithKline para la producción de la vacuna Priorix Tetra®, pero Una de las existencias originales.

Las compañías farmacéuticas que usan líneas celulares para la producción de medicamentos y vacunas tienen su propia línea MRC-5, pero este hecho no cambia nuestra duda, es decir, no hay una solicitud periódica de monitoreo de estabilidad genética, y este es un problema importante en nuestro vista, especialmente porque esto está permitido sin un límite de umbral.


Descargar: CORVELVA-Priorix-Tetra-humano-genoma-y-MRC-5-cell-line.pdf


Priorix Tetra® genoma humano y línea celular MRC-5 - estudio comparativo (estándar ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

La presencia del virus de la rubéola se demostró secuenciando una biblioteca de RNA-seq con una profundidad extremadamente alta (aproximadamente 260 millones de secuencias producidas por Illumina). Se han detectado 114 secuencias de 260 millones, equivalentes al 0.00004% del total de secuencias. Las secuencias del genoma de la rubéola se han confirmado manualmente con el software BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). La biblioteca secuenciada a menor profundidad (aproximadamente 12 millones de secuencias de coincidencia Illumina, equivalentes a 6 millones de fragmentos de biblioteca secuenciada) no había detectado la presencia de CUALQUIER lectura atribuible a la rubéola, en este lote.

Otras secuencias de virus presentes en la vacuna (varicela, sarampión y paperas) también se validaron de la misma manera manual, confirmando que se asignaron correctamente.


Introducción

Los secuenciadores de nueva generación se han convertido en herramientas de elección para el análisis detallado en el campo de la biología y la medicina, especialmente el de precisión. Estas herramientas permiten un enfoque nuevo y más global de una serie de aplicaciones, como la secuenciación de novo, la metagenómica, la epigenómica, la secuenciación del transcriptoma y la secuenciación del genoma.

La última aplicación (re-secuenciación) está muy extendida en el campo humano tanto para fines de investigación como de diagnóstico y consiste en la secuenciación con tecnología NGS (secuenciación de próxima generación) de un genoma individual completo para mapear mutaciones de un solo nucleótido (SNP, pronunciación) snip '), se produjeron inserciones y deleciones de secuencias más o menos largas en ciertas posiciones del genoma y variaciones en el número de copias de porciones de genoma / genes (CNV, Variantes de número de copia).

El procedimiento de secuenciación requiere que el ADN de un individuo se rompa mecánicamente en fragmentos de pequeño tamaño (400-500 pb) y estos fragmentos estén vinculados a tractos de ADN artificial llamados adaptadores, que permiten fijar los fragmentos de ADN humano a una superficie de vidrio. sobre el cual se leen las bases (A, C, G, T).

La lectura del ADN se obtiene mediante la incorporación de reacciones químicas de nucleótidos marcados con moléculas fluorescentes. Los millones de secuencias (lecturas) que se obtienen por secuenciación ocurrieron en la superficie del vidrio, luego se asignan a la referencia del genoma humano con el software apropiado, y luego se identifican todas las variantes presentes en el genoma analizado en comparación con la referencia.

Este mismo procedimiento se realizó en el genoma humano presente en Priorix Tetra® lote n. A71CB256A y en el ADN extraído de la línea celular MRC-5, registrado en 1966 en ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC es la organización líder mundial de recursos y estándares de materiales biológicos cuya misión se centra en la adquisición, autenticación, producción, preservación, desarrollo y distribución de microorganismos de referencia, líneas celulares y otros materiales estándar biológicos. Fue establecido en 1925, cuando un comité de científicos reconoció la necesidad de una colección centralizada de materiales biológicos que pudieran servir a los científicos de todo el mundo.

La línea celular MRC-5 se deriva del tejido pulmonar normal de un feto masculino de 14 semanas y fue depositada en ATCC por JP Jacobs en septiembre de 1966. Se declara que estas células pueden duplicar de 42 a 46 poblaciones antes de la senescencia. comienza. El artículo de referencia para esta línea celular se remonta a 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0


Resultados

Como se mostró anteriormente, el ADN humano presente en el lote Priorix Tetra®. n. A71CB256A (indicado en los siguientes gráficos como "muestra ID12051PT") es un genoma individual completo, es decir que está presente el ADN genómico de todos los cromosomas de un individuo masculino. Los gráficos de cobertura (profundidad media = cobertura promedio) de los 22 cromosomas humanos y de los cromosomas X e Y se muestran a continuación, para la vacuna (imagen de arriba) y la línea celular MRC5 (imagen de abajo).

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A continuación se muestran los resultados del análisis de los distintos tipos de variantes.


Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) e inserciones / deleciones cortas (InDels)

Las variantes del ADN individual (SNP, por sus siglas en inglés) son polimorfismos, es decir, variaciones del material genético, transmitidas por un solo nucleótido. Los 'InDels' son pequeñas inserciones y deleciones de menos de 50 pb de longitud y constituyen otra clase de variantes genómicas en el genoma humano.

SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) - ID12051PT

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SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) - MRC-5

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InDels (inserciones / eliminaciones cortas) - ID12051PT

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InDels (inserciones / eliminaciones cortas) - MRC-5

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CNV (Variantes de número de copia) y SV (Variantes estructurales)

Las variantes de número de copia (CNV) son variantes genómicas debido a variaciones en el número de copias de fragmentos relativamente grandes (más de 50 pb) en genomas individuales. Hay dos tipos de CNV: tipo 'ganancia' (ganancia de copias) y tipo 'pérdida' (pérdida de copias).

Las variantes estructurales (SV) son variantes genómicas con dimensiones relativamente grandes (> 50 pb) que incluyen deleciones, duplicaciones, inserciones, inversiones y translocaciones.

CNV (variantes de número de copia)

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SV (variantes estructurales)

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Visualización circular de genomas (trama circos)

A continuación se muestra una representación gráfica de los dos genomas llamados (diagrama de circos).

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Significado de los diversos círculos concéntricos.

  1. El círculo externo (primer círculo) es el número de cromosoma.
  2. El segundo anillo (azul) representa la cobertura de las lecturas de estilo histograma. Cada histograma es la cobertura promedio de un área de 0,5 Mbp.
  3. El tercer anillo (negro) representa la densidad de los INDEL en un "estilo de gráfico de dispersión". Cada punto negro se calcula como el número de INDEL (pequeñas inserciones / eliminaciones) en un rango de 1 Mbp.
  4. El cuarto anillo (verde) representa la densidad snp en un 'estilo de gráfico de dispersión'. Cada punto verde se calcula como el número de SNP (polimorfismos de un solo nucleótido) en un rango de 1 Mbp.
  5. El quinto anillo representa la proporción de SNP homocigoto (naranja) y heterocigoto (gris) en el estilo de histograma. Cada histograma se calcula a partir de una región de 1 Mbp.
  6. El sexto anillo representa la inferencia CNV (variantes de número de copia). El rojo significa que las piezas de ADN ganan y el verde significa pérdida.
  7. El anillo más central representa la inferencia SV (variantes estructurales) en las regiones exónicas y de empalme. TRA (translocación, naranja), INS (inserciones, verde), DEL (eliminaciones, gris), DUP (duplicaciones, rosa) e INV (inversiones, azul).

Los conclusiones

Estos dos genomas muestran diferencias importantes. Específicamente, el genoma de la vacuna está muy cambiado en comparación con el de la línea celular depositada en 1966. Se debe decir que no tuvimos la posibilidad de realizar la secuenciación de la línea celular utilizada por GlaxoSmithKline para la producción de la vacuna Priorix Tetra®, pero la del stock original. Las compañías farmacéuticas que usan líneas celulares para la producción de medicamentos y vacunas tienen su propia línea MRC-5, pero esto no cambia nuestras sospechas, es decir, el hecho de que el control de estabilidad genética no se requiere periódicamente es muy grave, en nuestra opinión, especialmente porque se permite estar presente sin límite de límite.


conclusiones

Los dos genomas muestran diferencias importantes. En particular, el genoma de la vacuna se ve muy modificado en comparación con el de la línea celular depositada en 1966. Hay que decir que no tuvimos la posibilidad de secuenciar la línea celular utilizada por GlaxoSmithKline para la producción de la vacuna Priorix Tetra, sino la del stock originales. Las compañías farmacéuticas que usan líneas celulares para la producción de medicamentos y vacunas tienen su línea MRC-5, pero esto no cambia nuestras sospechas, es el hecho de que el control de la estabilidad genética no es necesario periódicamente y esto es muy grave en nuestra opinión. , sobre todo porque se le permite estar presente sin límite.