Respuesta técnica a las críticas del Dr. Bucci.
Presentamos a continuación la respuesta técnica de la Dra. Loretta Bolgan a las críticas publicadas por la Dra. Bucci sobre los análisis de Corvelva.
Estimado Dr. Bucci,
a continuación respondo a los problemas críticos que planteó en particular en su artículo publicado en: Malos científicos.com
En primer lugar, me gustaría señalarles que el uso de tecnologías NGS / HTS (secuenciación de próxima generación o secuencia de alto rendimiento) NO es original en sustratos complejos de origen biotecnológico, como las vacunas.
La tecnología NGS ya se ha utilizado en productos de vacuna, por ejemplo:
- en el análisis de lotes comerciales de la vacuna contra rotavirus (Victoria JG, Wang C, Jones MS, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S, et al. Ácidos nucleicos virales en vacunas vivas atenuadas: detección de variantes minoritarias y un virus adventicio. J Virol 2010; 84: 6033-40) permitiendo el bloqueo posterior de la comercialización de lotes contaminados con circovirus porcino tipo 1 (PCV1), a pesar de haber aprobado previamente todas las pruebas requeridas para el desarrollo, ensayos clínicos y producción (Dubin, G., Toussaint, JF; Cassart, JP; Howe, B.; Boyce, D.; Friedland, L.; Abu-Elyazeed, R.; Poncelet, S.; Han, HH; Debrus, S. Investigación de una investigación de una agencia reguladora sobre el posible tipo de circovirus porcino 1 contaminación de la vacuna contra el rotavirus humano, Rotarix: enfoque y resultado. Hum. Vaccines Immunother. 2013, 9, 2398–2408).
- en la detección de un nuevo rabdovirus en la línea celular Sf9 (MH, Galvin TA, Glasner DR, Shaheduzzaman S, Khan AS. Identificación de un nuevo rabdovirus en líneas celulares Spodoptera frugiperda. J Virol 2014; 88: 6576–85)
- para identificar el virus de la vacuna contra las paperas en el cerebro de un niño inmunocomprometido que murió de encefalitis (Morfopoulou S, Mee ET, Connaughton SM, Brown JR, Gilmour K, Chong WK, Duprex WP, Ferguson D, Hubank M, Hutchinson C, Kaliakatsos M, McQuaid S, Paine S, Plagnol V, Ruis C, Virasami A, Zhan H, Jacques TS, Schepelmann S, Qasim W, Breuer J. La secuenciación profunda revela la persistencia del virus de la vacuna contra las paperas asociado a las células en la encefalitis crónica. Acta Neuropathol.2017 enero; 133 (1): 139-147. Doi: 10.1007 / s00401- 016-1629-y. Epub 2016 Oct 21. PubMed PMID: 27770235).
También en el trabajo colaborativo de 2017 'Un estudio multicéntrico para evaluar el rendimiento de la secuenciación de alto rendimiento para la detección de virus' (A Khan AS, Ng SHS, Vandeputte O, Aljanahi A, Deyati A, Cassart JP, Charlebois RL, Taliaferro LP. A Estudio multicéntrico para evaluar el rendimiento de la secuenciación de alto rendimiento para la detección de virus. MSphere. 2017 de septiembre de 13; 2 (5) .pii: e00307-17. Doi: 10.1128 / mSphere.00307-17. ECollection 2017 de septiembre a octubre. PubMed PMID : 28932815; PubMed Central PMCID: PMC5597969), se destaca como análisis realizados con diferentes instrumentos HTS, con diferentes protocolos de preparación de muestras y análisis de datos, en muestras que imitan materiales biológicos complejos, han mostrado una sensibilidad similar en la detección de virus en 3 varios talleres.
Finalmente, en el 'Informe de la conferencia internacional sobre secuenciación de próxima generación para la detección accidental de virus en productos biológicos' (Khan AS, Benetti L, Blumel J, Deforce D, Egan WM, Knezevic I, Krause PR, Mallet L, Mayet D, Minor PD , Neels P, Wang G. Informe de la conferencia internacional sobre secuenciación de próxima generación para la detección accidental de virus en biológicos. Biológicos. 2018 Sep; 55: 1-16. Doi: 10.1016 / j.biologicals.2018.08.002. Epub 2018 6 de agosto PubMed PMID: 30093175), informe de una conferencia internacional celebrada en Rockville (MD) del 26 al 27 de octubre de 2017, coorganizada por IABS (Alianza Internacional para la Estandarización Biológica) y la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU.), En Con la asistencia de ciento veintiocho científicos de 16 países diferentes, incluidos los investigadores Glaxo SmithKline, Merck y Sanofi, se afirma que:
“Las principales ventajas del NGS para las pruebas de seguridad para la detección de virus son el enfoque rápido y no dirigido, que puede usarse en múltiples sustratos y que permite detectar una amplia gama de virus, incluidas variantes y nuevas especies. ; y que no hay necesidad de amplificación específica, mientras que la PCR requiere apuntar a una secuencia específica "
Y, sin embargo:
"Las tecnologías HTS están revelando algunas de las limitaciones actuales de los programas para probar materiales biológicos y podrían integrar lagunas en estos programas y aumentar la seguridad del producto"
Y en las conclusiones del informe leemos:
"Los continuos esfuerzos científicos y de colaboración, los intercambios entre las agencias reguladoras y otros organismos públicos, la industria, los laboratorios académicos y los proveedores de servicios avanzarán en el campo de NGS con el objetivo de garantizar la seguridad de los productos orgánicos que impactan en la salud humana y animal"
A continuación respondo a sus observaciones, en particular a las que nos permiten explicar mejor los datos preliminares que hemos producido en algunos lotes de Priorix Tetra.
Observación 1
"Uno se pregunta cómo esta práctica de secreto, contrario a cualquier criterio de intercambio de datos, puede conciliarse con las continuas solicitudes de transparencia hechas por la asociación CORVELVA y por el presidente de la Orden Nacional de Biólogos en términos de seguridad de la vacuna: es legal ¿Lanzar una alarma sin proporcionar todos los datos necesarios para evaluar su coherencia?
¿Cómo pueden la comunidad científica y los ciudadanos evaluar el peso de ciertas afirmaciones, si los datos originales completos se mantienen en secreto, a la espera de que un fiscal decida si y cómo proceder con una acción judicial?
Respuesta 1
Los datos de metagenómica revelados por Corvelva para el Priorix Tetra (vacuna MPRV) y discutidos en el informe publicado en diciembre fueron preliminares (una versión actualizada fue revelada en el sitio web de Corvelva el 23 de enero, el resultado de un paso más en el análisis de datos), porque, como ya se reiteró en varias ocasiones, los datos divulgados hasta ahora son el resultado de un proceso de investigación y desarrollo tecnológico iniciado en 2017, con el objetivo de ajustar y optimizar todo el procedimiento, desde el procesamiento de la muestra hasta el análisis bioinformático. Se decidió divulgar los resultados durante el trabajo, a medida que estén disponibles, en absoluta transparencia (¡justo lo contrario de lo que usted declara como una 'práctica de secreto'!) Y, en cualquier caso, fuertemente respaldado por la literatura científica sobre 'argumento.
En nuestra opinión, lo que hemos revelado hasta ahora sobre esta vacuna, especialmente con respecto a la gran cantidad de ADN fetal humano, no es nada nuevo o inesperado y, lo que es menos, desconocido para las compañías farmacéuticas.
Observación 2
"Se puede ver fácilmente que el total de lecturas indicadas en la parte superior izquierda (resaltado en amarillo) es superior a 6 millones; sin embargo, la suma de todas las lecturas divididas por clase de organismo es de aproximadamente 5 millones y medio, con un "déficit" de más de 700.000 lecturas (y una suma porcentual, indicada por el cuadro rojo, igual al 88%). Esta simple adición, repetida en todas las tablas, hace la pregunta de dónde terminaron las lecturas faltantes (un porcentaje que ciertamente no es insignificante) y por qué no se han informado. La posibilidad de que los investigadores hayan cometido un error permanece abierta ".
Respuesta 2
Digamos que 700.000 lecturas cambian más o menos ligeramente la sustancia de los análisis preliminares realizados. Las secuencias faltantes se incluyen en el cálculo de secuencias 'no asignadas'. Como ya se mencionó, los datos no son definitivos y puede haber imprecisiones en los informes. Todo será revisado y corregido a medida que avance el trabajo.
Observación 3
“El genoma del virus de la rubéola, uno de los virus atenuados necesarios para conferir inmunogenicidad, no estaría presente. La detección a niveles muy bajos, en el límite del ruido estadístico, de un microorganismo en la muestra examinada no depende, por tanto, de su ausencia, sino del método de identificación no optimizado. Se puede encontrar la misma dificultad, idéntica, para la identificación de cualquier otro genoma, para el cual el método de análisis no ha sido calibrado adecuadamente; la falta de divulgación del genoma del virus de la rubéola (además de un virus monocatenario encapsulado) es, por tanto, atribuible al método utilizado, sin necesidad de invocar su ausencia en los lotes de vacuna examinados "
Respuesta 3
Su tesis es aceptable. Estamos en la fase de investigación y desarrollo, sin embargo, la tecnología es muy robusta y reconocida por la comunidad científica que se ocupa de la secuenciación profunda para la detección de virus en sustratos biológicos complejos. Las pruebas entre laboratorios y la introducción de estándares apropiados de mezclas virales certificadas nos permitirán verificar o refutar la hipótesis que usted propuso, es decir, que el método no está (todavía) optimizado para virus.
En cualquier caso, el genoma de la rubéola se encontró en el lote bajo examen, lo que aumentó la profundidad de secuenciación (114 secuencias de pares pares de 125 pb de largo, de aproximadamente 260 millones de secuencias producidas) como se describe en el segundo informe de enero de 2019. También en la vacuna MMRVax Pro de Merck, analizado en 2017 con el mismo método, se encontró el genoma del virus de la rubéola sin tener que ir a profundidades tan profundas, lo que demuestra que el método funciona.
Observación 4
“Se detectarían los genomas de numerosos organismos contaminantes que pertenecen a numerosos taxones, incluidos los helmintos, las bacterias y los virus patógenos humanos adventicios. También hay otro problema en las tablas presentadas, que consiste en la frecuencia abundante de secuencias atribuibles a virus integrados en el genoma humano (endovirus de diversa naturaleza) o secuencias retrovirales que se encuentran en el genoma humano normal (este es el caso, por ejemplo, de secuencias retrovirales integrados que pueden confundirse con el VIH) o en el genoma de las células embrionarias de pollo utilizadas para la producción de vacunas, que generalmente se encuentran como asignaciones falsas para contaminar genomas en la secuenciación de ADN o ARN dependiendo de la secuencia endose particular considerada. En primer lugar, hay numerosas especies enumeradas en las tablas de informes, que se encuentran en función de una serie de lecturas totalmente incluidas en el ruido estadístico. 3 o menos lecturas es un procedimiento arriesgado que conduce a una gran cantidad de falsos positivos "
Respuesta 4
La versión del informe divulgado en el sitio web de Corvelva en diciembre, al que hace referencia, se actualizó recientemente con una versión en la que una parte de los contaminantes se validó preliminarmente con un software alternativo, y luego manualmente. El primer análisis se realizó deliberadamente sin filtros para resaltar todas las señales posibles y todos los problemas relacionados con un análisis "abierto". El propósito de nuestro trabajo no es, como se reitera varias veces, llevar a cabo un análisis de la liberación del lote, sino llevar a cabo un examen preliminar y, posteriormente, una confirmación entre laboratorios sobre los problemas críticos que han surgido, mediante el uso de una tecnología bien establecida en el campo. genómica, ya aplicada en vacunas y próximamente también por agencias reguladoras y grandes compañías farmacéuticas para aumentar la calidad y, en consecuencia, la seguridad del producto.
Si define el límite de 3 lecturas (¿en base a qué?), Entonces al menos podríamos pensar que los signos de presencia de retrovirus endógenos en esta vacuna son probables (Retrovirus endógeno humano K: 32 lecturas de 125 pb, correspondientes a 4000 pb y HERVH- env 62: 4 lecturas, correspondientes a 500 pb), en los datos de RNA-seq, que por definición representan el material transcrito y, por lo tanto, potencialmente activo.
En cambio, estoy de acuerdo con usted en que las secuencias retrovirales que se encuentran en los datos de la secuencia de ADN pueden ser provirus integrados en el genoma humano, dada la gran cantidad de ADN humano en la vacuna en cuestión.
Recuerdo que en la vacuna Attenuvax (vacuna contra el sarampión), 4 secuencias que cubren 700 pb (Victoria JG, Wang C, Jones MS, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S, et al. Ácidos nucleicos virales en vacunas vivas atenuadas: detección de variantes minoritarias y un virus adventicio. J Virol 2010; 84: 6033–40) permitió detectar por NGS una contaminación del virus del virus de la leucosis aviar (ALV) por primera vez en una vacuna, luego se confirmó mediante PCR anidada.
Observación 5
"Con respecto al primero de estos contaminantes potenciales, la bacteria fijadora de nitrógeno no patógena Bradyrhizobium, su" aparición "en los laboratorios de secuenciación Es bien conocido como un problema relacionado con la preparación de las muestras a secuenciar, atribuible a la contaminación de kits de purificación de ADN, agua y reactivos a utilizar. Un problema bien conocido, en el que en el trabajo de genómica "exploratoria", una muestra de control, por ejemplo que contiene agua, se secuencia en paralelo a la muestra bajo examen "
Respuesta 5
Los blancos se hicieron (tanto de extracción como de la biblioteca), pero no se obtuvieron bibliotecas y, por lo tanto, no fue posible ejecutarlos en el secuenciador para verificar exactamente cuál es el reactivo / contaminación ambiental. Sin embargo, se están haciendo esfuerzos para tratar de comprender qué son las contaminaciones 'fisiológicas' y las pruebas entre laboratorios también ayudarán a determinar posibles contaminaciones bacterianas dependientes del laboratorio.
Observación 6
“En cuanto a los dos tipos de gusanos revelados en el análisis de secuenciación de ARN, es suficiente observar cómo no están presentes en los análisis de secuenciación de ADN correspondientes, donde deberían ser mucho mejor detectables; en consecuencia, la presencia real de las dos especies aparece como un artefacto, que no puede confirmarse a la luz de los mismos datos de secuenciación de ADN presentados.
A la luz de las consideraciones hechas, por lo tanto, no es posible confirmar la presencia de ninguno de los genomas contaminantes reportados, y existen fuertes indicios que nos llevan a pensar en la presencia de numerosos falsos positivos "
Respuesta 6
La segunda versión del informe ya ha proporcionado una primera validación de algunos organismos encontrados, tanto con software alternativo como de forma manual.
La evaluación de las atribuciones incorrectas del software Kraken (además uno de los programas más utilizados por la comunidad científica para análisis metagenómicos de genoma completo) se está utilizando para desarrollar una tubería de bioinformática ad hoc para este tipo de análisis, que no requiere el uso de otros. software e inspección manual (además, común en el campo de la metagenómica para problemas de vanguardia debido a la ausencia de bases de datos específicas y particularmente precisas).
Observación 7
"El ADN humano detectado sería de alto peso molecular y la cobertura del genoma humano sería total, de modo que todo el genoma de las células fetales humanas y no partes de él estaría presente en los lotes de vacunas examinados.
"En la vacuna Priorix Tetra, el ADN genómico humano es de alto peso molecular (> 10.000 pb) y la cobertura secuencial total de todo el genoma humano de referencia (HG-19) muestra que es el genoma completo de las células fetales utilizadas para el cultivo del virus de la vacuna debe estar presente y no solo partes del mismo. "
No se proporciona evidencia directa de la declaración declarada, sin perjuicio de la presencia de ADN que pesa alrededor de 100.000 bases reveladas por electroforesis en gel por los autores (documentado con una cifra de baja calidad en el documento de CORVELVA, del cual sería aconsejable obtener un original alto resolución para evaluar si los datos se presentan de manera intacta).
Sin embargo, los autores olvidan que el ADN de algunos de los virus atenuados presentes en la vacuna en cuestión es aproximadamente del mismo tamaño que el que revelaron en el gel (por ejemplo, el ADN del virus de la varicela es de 125 kb); por lo tanto, incluso si desea vislumbrar un rastro de ADN de alto peso en la imagen de gel presentada, esto puede atribuirse claramente al ADN de los virus atenuados presentes en la vacuna, y no a fragmentos de ADN humano. Nuevamente, nos enfrentamos a una sobreinterpretación del resultado experimental. En cuanto al segundo elemento en el que se basa la afirmación de CORVELVA, es decir, que todo el genoma humano estaría presente en las vacunas, recordamos que ni siquiera es necesario tener acceso a los datos detallados de cobertura para evaluar su consistencia: profundidad de secuencia utilizada y con el número de lecturas obtenidas, esta afirmación es totalmente inverosímil. Además, la técnica de secuenciación utilizada, basada en secuencias cortas, 125 nucleótidos, no permite definir si un genoma está fragmentado. La técnica de secuenciación utilizada solo permite estimar la fracción de ADN genómico secuenciado "
Respuesta 7
El ADN humano en esta vacuna es aproximadamente de 8 a 1 en relación con el ADN de la varicela (el 88% de las lecturas son de origen humano, en comparación con el 11% de la varicela en el último lote analizado A71CB256A). Otros virus de ADNds atenuados no están presentes en la vacuna porque los virus del sarampión, las paperas y la rubéola son virus de ARN monocatenario que no se pueden ver en el gel de agarosa. NGS es una tecnología cuantitativa, por lo tanto, una simple cuantificación fluorimétrica del ADN total extraído de la vacuna (por ejemplo, lote. A71CB256A = 3,7 microgramos por dosis), asociada con la consideración de la cuantificación relativa realizada anteriormente (8: 1), nos permite para poder decir que el ADN celular es de aproximadamente 2,9 microgramos por dosis, en comparación con aproximadamente 0.74 microgramos de ADN de la varicela. Por lo tanto, es plausible que al menos una parte del ADN de alto peso molecular visto en el gel pueda ser el de las células de la línea celular fetal MRC5.
La evidencia directa de que dentro de este producto hay un genoma humano COMPLETO (es decir, con genes y secuencias no codificantes), fragmentados o no, está dada por el resultado de la alineación de las lecturas derivadas de humanos en la referencia humana hg19.
La siguiente tabla, resaltada en naranja, muestra el resultado expresado en 'Av_cov = cobertura promedio' del alineamiento de las secuencias humanas de los 3 lotes de Priorix probados (1º, 2º y 3º lote) en cromosomas humanos. En la columna 1, chrM es ADN mitocondrial, mientras que Chr1 a ChrY son los cromosomas humanos ensamblados, incluidos los cromosomas sexuales X e Y. La columna 2 muestra la longitud de los cromosomas humanos ensamblados expresados en pares de bases.
La cobertura es baja (Avg_cov en promedio a lo largo de cada cromosoma <de 1x) pero la homogeneidad de la distribución de las lecturas que se alinean de forma única, a lo largo de todos los cromosomas humanos y la presencia también de lecturas que se alinean con una mayor cobertura en el genoma mitocondrial (en las células humanas hay 2 genomas, uno nuclear de aproximadamente 3Gbp grande y dividido en cromosomas y uno más pequeño, circular, de aproximadamente 16Kbp mitocondrial), sin embargo, nos permite reconocer sin duda una situación similar a una secuenciación del genoma de paso bajo de un genoma humano. individual. Para una mejor comprensión de lo expuesto, en la parte indicada en verde hay una secuenciación del genoma completo de paso bajo humano (5 muestras, 4 hembras y 1 macho) a una profundidad similar a la producida para los 3 lotes de vacuna de Priorix Tetra.
Una indicación del sexo del individuo (probablemente hombre) en la vacuna también se puede deducir de la relación entre la cobertura promedio para los cromosomas X e Y.
El ADN humano contenido en los lotes secuenciados previamente de Priorix también ha sido calificado como perteneciente a la línea fetal MRC-5, que es la línea celular continua del tejido pulmonar de un feto abortivo masculino de los años 60, en el que el virus de varicela y rubéola. El análisis de las variantes del ADN mitocondrial presente en la vacuna en comparación con el ADN mitocondrial de la línea MRC-5 (el ADN de la línea celular se adquirió de ATCC, el principal recurso de materiales biológicos estándar en el mundo) muestra que son el mismo individuo.
Observación 8
"Durante mucho tiempo ha habido evidencia de que incluso dosis muy altas de ADN humano no pueden inducir riesgos significativos incluso durante largos períodos de observación, según lo confirmado por estudios sobre primates no humanos, de la experiencia clínica con vacunas y otras drogas biológicas y de estudios recientes de evaluación de riesgos que sugieren que incluso en aquellos países no europeos donde hay umbrales para la cantidad de ADN inyectable, estos umbrales son innecesariamente estrictos "
Respuesta 8
El artículo de 1995 (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104510568570036X?via%3Dihub) citado por usted, se refiere a un estudio sobre primates, que en mi opinión ciertamente no es suficiente para demostrar la ausencia de infectividad, oncogenicidad y autoinmunidad del ADN humano inyectado en niños, como lo afirman los mismos autores en la parte final de la discusión. En el experimento, se inyecta una gran cantidad de ADN humano en los monos, por lo tanto, no en el ADN de la misma especie.
El segundo artículo citado (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23569076) establece muy claramente que el ADN residual es infeccioso a 2 microgramos, incluso si, en cualquier caso, este límite se obtiene de una evaluación estadística y no de datos experimentales. En cualquier caso, siguiendo las indicaciones del autor, la vacuna Priorix tendría una cantidad de ADN fetal claramente en línea con la determinada como en riesgo de enfermedad infecciosa.
Merck para la vacuna Varivax (varicela, virus vivo atenuado) declara en el folleto americano la presencia de ADN fetal humano derivado de células MRC-5 que, según los análisis realizados por el Dr. Deisher, parece estar en una cantidad de aproximadamente 2 microgramos.
Sin embargo, en el caso del folleto italiano del Priorix Tetra, no se indica la presencia de ADN de la línea MRC-5, a pesar de estar en cantidades del mismo orden de magnitud que el contenido en el Varivax estadounidense. En cualquier caso, 2 microgramos de ADN fetal de MRC-5 no son, en mi opinión, una cantidad residual, sino un componente real de la vacuna.
Los estudios in vitro del Dr. Deisher, que esperamos se publiquen en breve, desafortunadamente muestran resultados desconcertantes cuando una vacuna que contiene ADN humano fetal (hipometilado) se incuba in vitro con células madre hematopoyéticas humanas. Pero esperamos que se publique la investigación y luego podemos encontrarnos nuevamente sobre el tema.
Loretta Bolgan *
* Doctor en química y tecnologías farmacéuticas, con un doctorado en ciencias farmacéuticas de la escuela de medicina de Harvard Boston. Trabajó en el sector de la industria farmacéutica donde se ocupó del registro y desarrollo de proyectos de investigación en el campo de la oncología. Parte consultora de la ley 210/92, contaminación ambiental y enfermedades profesionales, participó en la última comisión parlamentaria de investigación sobre uranio empobrecido en el grupo de vacunas. Consultor actual de la Orden Nacional de Biólogos para la toxicología de medicamentos y vacunas, también se ocupa de nutrición y terapias complementarias.