Réponse technique aux critiques du Dr Bucci

Réponse technique aux critiques du Dr Bucci

Nous rapportons ci-dessous la réponse technique du Dr Loretta Bolgan aux critiques publiées par le Dr Bucci sur les analyses de Corvelva.


Cher Dr. Bucci,

ci-dessous, je réponds aux questions critiques que vous avez soulevées en particulier dans votre article publié sur: CattiviScienziati.com

Tout d'abord, je voudrais vous signaler que l'utilisation des technologies NGS / HTS (Next Generation Sequencing ou High-Throughput Sequencing) n'est PAS originale sur des substrats complexes d'origine biotechnologique, tels que les vaccins.

La technologie NGS a déjà été utilisée dans les produits vaccinaux, par exemple:

  • dans l'analyse des lots commerciaux du vaccin antirotavirus (Victoria JG, Wang C, Jones MS, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S, et al. Acides nucléiques viraux dans les vaccins vivants atténués: détection de variantes minoritaires et d'un virus adventice. J Virol 2010; 84: 6033–40) permettre le blocage ultérieur de la commercialisation des lots contaminés par le circovirus porcin de type 1 (PCV1), malgré avoir passé au préalable tous les tests nécessaires au développement, aux essais cliniques et à la production (Dubin, G.; Toussaint, JF; Cassart, JP; Howe, B.; Boyce, D.; Friedland, L.; Abu-Elyazeed, R.; Poncelet, S.; Han, HH; Debrus, S.Enquête sur une enquête d'un organisme de réglementation sur le type potentiel de circovirus porcin 1 contamination du vaccin contre le rotavirus humain, Rotarix: approche et résultat. Hum. Vaccines Immunother. 2013, 9, 2398-2408).

  • dans la détection d'un nouveau Rhabdovirus dans la lignée cellulaire Sf9 (MH, Galvin TA, Glasner DR, Shaheduzzaman S, Khan AS. Identification d'un nouveau rhabdovirus dans des lignées cellulaires de Spodoptera frugiperda. J Virol 2014; 88: 6576–85)

  • pour identifier le virus du vaccin contre les oreillons dans le cerveau d'un enfant immunodéprimé décédé d'encéphalite (Morfopoulou S, Mee ET, Connaughton SM, Brown JR, Gilmour K, Chong WK, Duprex WP, Ferguson D, Hubank M, Hutchinson C, Kaliakatsos M, McQuaid S, Paine S, Plagnol V, Ruis C, Virasami A, Zhan H, Jacques TS, Schepelmann S, Qasim W, Breuer J.Le séquençage profond révèle la persistance du virus du vaccin contre les oreillons associé aux cellules dans l'encéphalite chronique. Acta Neuropathol.2017 Jan; 133 (1): 139-147. Doi: 10.1007 / s00401- 016-1629-y. Publication en ligne le 2016 octobre 21 PubMed PMID: 27770235).

Également dans le travail collaboratif de 2017 `` A Multicenter Study To Evaluate the Performance of High-Throughput Sequencing for Virus Detection '' (A Khan AS, Ng SHS, Vandeputte O, Aljanahi A, Deyati A, Cassart JP, Charlebois RL, Taliaferro LP. A Étude multicentrique pour évaluer les performances du séquençage à haut débit pour la détection de virus. MSphere. 2017 sept. 13; 2 (5) .pii: e00307-17. Doi: 10.1128 / mSphere.00307-17. ECollection 2017 sept.-Oct. PubMed PMID : 28932815; PubMed Central PMCID: PMC5597969), il est mis en évidence comment les analyses effectuées avec différents instruments HTS, avec différents protocoles de préparation d'échantillons et d'analyse de données, sur des échantillons imitant des matériaux biologiques complexes, ont montré une sensibilité similaire dans la détection des virus dans 3 plusieurs ateliers.

Enfin, dans le `` Rapport de la conférence internationale sur le séquençage de prochaine génération pour la détection des virus adventices dans les produits biologiques '' (Khan AS, Benetti L, Blumel J, Deforce D, Egan WM, Knezevic I, Krause PR, Mallet L, Mayet D, Minor PD , Neels P, Wang G.Rapport de la conférence internationale sur le séquençage de prochaine génération pour la détection des virus adventices dans les produits biologiques.Biologie.sep 2018; 55: 1-16. Doi: 10.1016 / j.biologicals.2018.08.002. Epub 2018 6 août PubMed PMID: 30093175), rapport d'une conférence internationale tenue à Rockville (MD) du 26 au 27 octobre 2017, co-organisée par l'IABS (International Alliance for Biological Standardization) et la FDA (US Food and Drug Administration), en en présence de cent vingt-huit scientifiques de 16 pays différents, dont les chercheurs Glaxo SmithKline, Merck et Sanofi, il est indiqué que:

«Les principaux avantages du NGS pour les tests de sécurité pour la détection de virus sont l'approche rapide et non ciblée, qui peut être utilisée dans plusieurs substrats et qui permet de détecter une large gamme de virus, y compris des variantes et de nouvelles espèces. ; et qu'il n'y a pas besoin d'amplification spécifique, alors que la PCR nécessite de cibler une séquence spécifique "

Et pourtant:

"Les technologies HTS révèlent certaines des limites actuelles des programmes de test de matériel biologique et pourraient intégrer des lacunes dans ces programmes et accroître la sécurité des produits"

Et dans les conclusions du rapport, nous lisons:

"Des efforts collaboratifs et scientifiques continus, des échanges entre les organismes de réglementation et d'autres organismes publics, l'industrie, les laboratoires universitaires et les prestataires de services feront progresser le domaine des NGS dans le but de garantir la sécurité des produits biologiques qui ont un impact sur la santé humaine et animale"

Je réponds ci-dessous à vos observations, notamment à celles qui nous permettent de mieux expliquer les données préliminaires que nous avons produites sur certains lots de Priorix Tetra.


Remarque 1

"On se demande comment cette pratique du secret, contraire à tout critère de partage des données, peut être conciliée avec les demandes continues de transparence faites par l'association CORVELVA et par le président de l'Ordre national des biologistes en matière de sécurité des vaccins: elle est légale lancer une alarme, sans fournir toutes les données nécessaires pour évaluer sa cohérence?
Comment la communauté scientifique et les citoyens peuvent-ils évaluer le poids de certaines allégations, si les données originales complètes sont gardées secrètes, en attendant qu'un procureur public décide si et comment engager une action en justice? "

Réponse 1

Les données métagénomiques divulguées par Corvelva pour le Priorix Tetra (vaccin MPRV) et discutées dans le rapport publié en décembre étaient préliminaires (une version mise à jour a été divulguée sur le site Web de Corvelva le 23 janvier, résultat d'une nouvelle étape dans l'analyse des données), car, comme cela a déjà été rappelé à plusieurs reprises, les données divulguées à ce jour résultent d'un processus de recherche et de développement technologique entamé en 2017, dans le but d'affiner et d'optimiser l'ensemble de la procédure, du traitement de l'échantillon à l'analyse bioinformatique. Il a été décidé de divulguer les résultats au cours des travaux, au fur et à mesure de leur disponibilité, dans une transparence absolue (tout le contraire de ce que vous déclarez être une «pratique du secret»!) Et en tout cas fortement soutenu par la littérature scientifique sur la « argument.

À notre avis, ce que nous avons divulgué jusqu'à présent sur ce vaccin, en particulier en ce qui concerne la grande quantité d'ADN fœtal humain, n'est rien de nouveau ou d'inattendu et surtout pas connu des sociétés pharmaceutiques.


Remarque 2

«On peut facilement voir que le total des lectures indiqué en haut à gauche (surligné en jaune) dépasse 6 millions; cependant, la somme de toutes les lectures divisée par classe d'organismes est d'environ 5 millions et demi, avec un "manque à gagner" de plus de 700.000 88 lectures (et une somme en pourcentage, indiquée par l'encadré rouge, égale à XNUMX%). Ce simple ajout, répété sur tous les tableaux, pose la question de savoir où se sont retrouvées les lectures manquantes (pourcentage certainement non négligeable) et pourquoi elles n'ont pas été signalées. La possibilité que les chercheurs se soient trompés reste clairement ouverte "

Réponse 2

Disons que 700.000 XNUMX lectures modifient plus ou moins légèrement le fond des analyses préliminaires de dépistage effectuées. Les séquences manquantes sont incluses dans le calcul des séquences «non attribuées». Comme déjà mentionné, les données ne sont pas définitives et il peut y avoir des inexactitudes dans les rapports. Tout sera revu et corrigé au fur et à mesure de l'avancement des travaux.


Remarque 3

«Le génome du virus de la rubéole, l'un des virus atténués nécessaires pour conférer l'immunogénicité, ne serait pas présent. La détection à des niveaux très bas, à la limite du bruit statistique, d'un microorganisme dans l'échantillon à examiner ne dépend donc pas de son absence, mais de la méthode d'identification non optimisée. La même difficulté, identique, peut être rencontrée pour l'identification de tout autre génome, pour lequel la méthode d'analyse n'a pas été convenablement calibrée; l'absence de divulgation du génome du virus de la rubéole (d'ailleurs un virus monocaténaire encapsulé) est donc imputable à la méthode utilisée, sans qu'il soit nécessaire d'invoquer son absence dans les lots de vaccins examinés "

Réponse 3

Sa thèse est acceptable. Nous sommes en phase de recherche et développement, mais la technologie est très robuste et reconnue par la communauté scientifique qui s'occupe du séquençage profond pour la détection de virus dans des substrats biologiques complexes. Des tests interlaboratoires et l'introduction de normes de mélange viral certifiées appropriées nous permettront de vérifier ou d'infirmer l'hypothèse que vous proposez, c'est-à-dire que la méthode n'est pas (encore) optimisée pour les virus.

Dans tous les cas, le génome de la rubéole a ensuite été retrouvé dans le lot à l'examen, augmentant la profondeur de séquençage (114 séquences appariées de 125 pb de long, sur environ 260 millions de séquences produites) comme décrit dans le deuxième rapport de janvier 2019. Aussi dans le vaccin MMRVax Pro de Merck, analysé en 2017 avec la même méthode, le génome du virus de la rubéole a été trouvé sans avoir à aller à des profondeurs aussi profondes, prouvant que la méthode fonctionne.


Remarque 4

«Les génomes de nombreux organismes contaminants appartenant à de nombreux taxons seraient détectés, y compris les helminthes, les bactéries et les virus pathogènes humains adventices. Il existe également un autre problème dans les tableaux présentés, consistant en l'abondante fréquence des séquences attribuables aux virus intégrés dans le génome humain (endovirus de nature diverse) ou aux séquences rétrovirales connues pour se retrouver dans le génome humain normal (c'est le cas par exemple des séquences rétroviraux intégrés qui peuvent être confondus avec le VIH) ou dans le génome de cellules embryonnaires de poulet utilisées pour la production de vaccins, généralement trouvés comme de fausses affectations à des génomes contaminants dans le séquençage de l'ADN ou de l'ARN en fonction de l'endoséquence particulière considérée. Tout d'abord, il existe de nombreuses espèces répertoriées dans les tableaux de rapport, qui se trouvent sur la base d'un certain nombre de lectures entièrement incluses dans le bruit statistique. 3 lectures ou moins est une procédure risquée qui conduit à un nombre élevé de faux positifs "

Réponse 4

La version du rapport divulguée sur le site Web de Corvelva en décembre, à laquelle vous vous référez, a été mise à jour récemment avec une version dans laquelle une partie des contaminants a été préalablement validée avec un logiciel alternatif, puis manuellement. La première analyse avait été délibérément réalisée sans filtres pour mettre en évidence tous les signaux possibles et tous les problèmes liés à une analyse «ouverte». Le but de nos travaux n'est pas, comme cela a été répété à plusieurs reprises, d'effectuer une analyse de la libération des lots, mais de procéder à un dépistage préliminaire, puis à une confirmation interlaboratoires des problèmes critiques qui sont apparus, grâce à l'utilisation d'une technologie bien établie sur le terrain. génomique, déjà appliqué sur les vaccins et à venir également par les organismes de réglementation et les grandes sociétés pharmaceutiques pour augmenter la qualité et par conséquent la sécurité du produit.

Si vous définissez la limite de 3 lectures (sur la base de quoi?), Alors nous pourrions au moins penser que les signes de présence de rétrovirus endogènes dans ce vaccin sont probables (Human Endogeneous Retrovirus K: 32 lectures de 125 pb, correspondant à 4000 pb et HERVH- env 62: 4 lectures, correspondant à 500 pb), dans les données ARN-seq, qui par définition représentent le matériel transcrit et donc potentiellement actif.

Au lieu de cela, je suis d'accord avec vous que les séquences rétrovirales trouvées dans les données ADN-seq peuvent être des provirus intégrés dans le génome humain, étant donné la très grande quantité d'ADN humain dans le vaccin en question.

Je me souviens que dans le vaccin Attenuvax (vaccin contre la rougeole), 4 séquences couvrant 700 pb (Victoria JG, Wang C, Jones MS, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S, et al. Acides nucléiques viraux dans les vaccins vivants atténués: détection de variantes minoritaires et virus adventice (J Virol 2010; 84: 6033–40) ont permis de détecter par NGS une contamination par le virus de la leucose aviaire (ALV) pour la première fois dans un vaccin, puis confirmée par PCR nichée.


Remarque 5

"En ce qui concerne le premier de ces contaminants potentiels, la bactérie fixatrice d'azote non pathogène Bradyrhizobium, son" apparence "dans les laboratoires de séquençage il est bien connu comme un problème lié à la préparation des échantillons à séquencer, attribuable à la contamination des kits de purification d'ADN, de l'eau et des réactifs à utiliser. Un problème bien connu, dans lequel dans le travail de génomique "exploratoire" un échantillon témoin, par exemple contenant de l'eau, est séquencé en parallèle de l'échantillon examiné "

Réponse 5

Les blancs ont été fabriqués (à la fois à partir de l'extraction et de la bibliothèque), mais les bibliothèques n'ont pas été obtenues et, par conséquent, il n'a pas été possible de les exécuter sur le séquenceur pour vérifier exactement ce qu'est le réactif / contamination environnementale. Cependant, des efforts sont faits pour essayer de comprendre ce que sont les contaminations «physiologiques» et des tests interlaboratoires aideront également à déterminer d'éventuelles contaminations bactériennes liées au laboratoire.


Remarque 6

«Quant aux deux types de vers révélés dans l'analyse de séquençage d'ARN, il suffit d'observer comment ils ne sont pas présents dans les analyses de séquençage d'ADN correspondantes, où ils devraient être beaucoup mieux détectables; par conséquent, la présence réelle des deux espèces apparaît comme un artefact, qui ne peut pas être confirmé à la lumière des mêmes données de séquençage d'ADN présentées.

À la lumière des considérations faites, il n'est donc pas possible de confirmer la présence de l'un des génomes contaminants signalés, et il existe des indices forts qui nous amènent à penser à la présence de nombreux faux positifs "

Réponse 6

La deuxième version du rapport a déjà prévu une première validation de certains organismes trouvés, à la fois avec des logiciels alternatifs et manuellement.

L'évaluation des attributions incorrectes du logiciel Kraken (en outre l'un des logiciels les plus couramment utilisés par la communauté scientifique pour les analyses métagénomiques du génome entier) est utilisée pour développer un pipeline bioinformatique ad hoc pour ce type d'analyse, qui ne nécessite pas l'utilisation d'autres. inspection logicielle et manuelle (d'ailleurs courante dans le domaine de la métagénomique pour les problèmes de pointe dus à l'absence de bases de données spécifiques et particulièrement précises).


Remarque 7

"L'ADN humain détecté aurait un poids moléculaire élevé et la couverture du génome humain serait totale, de sorte que l'ensemble du génome des cellules fœtales humaines et non des parties de celui-ci serait présent dans les lots de vaccins examinés.

"Dans le vaccin Priorix Tetra, l'ADN génomique humain est de poids moléculaire élevé (> 10.000 19 pb) et la couverture séquentielle totale de l'ensemble du génome humain de référence (HG-XNUMX) démontre qu'il s'agit de l'ensemble du génome des cellules foetales utilisées pour la culture du virus du vaccin doit être présente et pas seulement des portions de celle-ci. "

Aucune preuve directe n'est donnée pour la déclaration déclarée, sans préjudice de la présence d'ADN pesant environ 100.000 XNUMX bases révélée par électrophorèse sur gel par les auteurs (documentée avec un chiffre de mauvaise qualité dans le document CORVELVA, dont il serait conseillé d'obtenir un original élevé résolution pour évaluer si les données sont présentées de manière intacte).

Cependant, les auteurs oublient que l'ADN de certains des virus atténués présents dans le vaccin en question est à peu près de la même taille que ce qu'ils ont révélé dans le gel (par exemple, l'ADN du virus de la varicelle est de 125 kb); par conséquent, même si vous souhaitez apercevoir des traces d'ADN de poids élevé dans l'image de gel présentée, cela peut clairement être attribué à l'ADN des virus atténués présents dans le vaccin, et non à des fragments d'ADN humain. Encore une fois, nous sommes confrontés à une surinterprétation du résultat expérimental. Quant au deuxième élément sur lequel se fonde la revendication CORVELVA, à savoir que l'ensemble du génome humain serait présent dans les vaccins, nous nous souvenons qu'il n'est même pas nécessaire d'avoir accès aux données de couverture détaillées pour peser sa cohérence: profondeur de séquençage utilisée et avec le nombre de lectures obtenues, cette affirmation est totalement invraisemblable. Par ailleurs, la technique de séquençage utilisée, basée sur des séquences courtes, 125 nucléotides, ne permet pas de définir si un génome est fragmenté. La technique de séquençage utilisée permet uniquement d'estimer la fraction d'ADN génomique séquencé "

Réponse 7

L'ADN humain dans ce vaccin est d'environ 8 à 1 par rapport à l'ADN de la varicelle (88% des lectures sont d'origine humaine, contre 11% de la varicelle dans le dernier lot analysé A71CB256A). D'autres virus à ADNdb atténués ne sont pas dans le vaccin car les virus de la rougeole, des oreillons et de la rubéole sont des virus à ARN simple brin qui ne peuvent pas être visualisés sur du gel d'agarose. Le NGS est une technologie quantitative, donc une simple quantification fluorimétrique de l'ADN total extrait du vaccin (par exemple lot A71CB256A = 3,7 microgrammes par dose), associée à la prise en compte de la quantification relative faite ci-dessus (8: 1), nous permet pour pouvoir dire que l'ADN cellulaire est d'environ 2,9 microgrammes par dose, contre environ 0.74 microgramme d'ADN de varicelle. Il est donc plausible qu'au moins une partie de l'ADN de haut poids moléculaire vu sur gel puisse être celle des cellules de la lignée cellulaire fœtale MRC5.

La preuve directe qu'il existe dans ce produit un génome humain COMPLET (c'est-à-dire avec des gènes et des séquences non codants), fragmenté ou non, est donnée par le résultat de l'alignement des lectures d'origine humaine sur la référence humaine hg19.

Le tableau suivant, surligné en orange, montre le résultat exprimé en 'Av_cov = couverture moyenne' de l'alignement des séquences humaines des 3 lots de Priorix testés (1er, 2ème et 3ème lot) sur les chromosomes humains. Dans la colonne 1, chrM est l'ADN mitochondrial, tandis que Chr1 à ChrY sont les chromosomes humains assemblés, y compris les chromosomes sexuels X et Y. La colonne 2 montre la longueur des chromosomes humains assemblés exprimée en paires de bases.

Tableau bucci lettre vaccingate

La couverture est faible (Avg_cov en moyenne le long de chaque chromosome <à 1x) mais l'homogénéité de la distribution des lectures qui s'alignent de manière unique, le long de tous les chromosomes humains et la présence également de lectures qui s'alignent avec une couverture plus élevée sur le génome mitochondrial (dans les cellules humaines, il y a 2 génomes, un nucléaire d'environ 3 Gbp grand et divisé en chromosomes et un plus petit, circulaire, d'environ 16 Kbp mitochondrial), cependant, nous permet de reconnaître sans conteste une situation similaire à un séquençage du génome passe-bas d'un génome humain individuel. Pour une meilleure compréhension de ce qui est dit, dans la partie indiquée en vert, il y a un séquençage du génome entier passe-bas humain (5 échantillons, 4 femelles et 1 mâle) à une profondeur similaire à celle produite pour les 3 lots de vaccins de Priorix Tetra.

Une indication du sexe de l'individu (probablement le mâle) dans le vaccin peut également être déduite de la relation entre la couverture moyenne pour les chromosomes X et Y.

L'ADN humain contenu dans les lots de Priorix précédemment séquencés a également été qualifié d'appartenance à la lignée fœtale MRC-5, c'est-à-dire la lignée cellulaire continue du tissu pulmonaire d'un fœtus avorté mâle des années 60, dans lequel le virus du varicelle et rubéole. L'analyse des variantes de l'ADN mitochondrial présent dans le vaccin par rapport à l'ADN mitochondrial de la lignée MRC-5 (l'ADN de la lignée cellulaire a été achetée à ATCC, la principale ressource de matériel biologique standard dans le monde) montre qu'il s'agit du même individu.


Remarque 8

"Il existe depuis longtemps des preuves que même des doses très élevées d'ADN humain ne peuvent pas induire de risques importants même sur de longues périodes d'observation, comme le confirme études sur des primates non humains, de l'expérience clinique avec les vaccins et autres médicaments biologiques et de études récentes d'évaluation des risques ce qui suggère que même dans les pays non européens où il existe des seuils pour la quantité d'ADN injectable, ces seuils sont inutilement rigoureux "

Réponse 8

L'article de 1995 (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104510568570036X?via%3Dihub) que vous avez cité concerne une étude sur les primates qui, à mon avis, n'est certainement pas suffisante pour démontrer l'absence d'infectiosité, d'oncogénicité et d'auto-immunité de l'ADN humain injecté aux enfants, comme l'ont déclaré les mêmes auteurs dans la dernière partie de la discussion. Dans l'expérience, une grande quantité d'ADN humain est injectée à des singes, donc pas d'ADN de la même espèce.

Le deuxième article cité (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23569076) indique très clairement que l'ADN résiduel est infectieux à 2 microgrammes, même si en tout cas cette limite est obtenue à partir d'une évaluation statistique et non à partir de données expérimentales. En tout état de cause, selon les indications de l'auteur, le vaccin Priorix aurait une quantité d'ADN fœtal clairement en ligne avec celle déterminée comme à risque de maladie infectieuse.

Merck pour le vaccin Varivax (varicelle, virus vivant atténué) déclare dans la brochure américaine la présence d'ADN fœtal humain dérivé de cellules MRC-5 qui, d'après les analyses effectuées par le Dr Deisher, semble être en quantité d'environ 2 microgrammes.

Dans le cas de la brochure italienne du Priorix Tetra, cependant, la présence d'ADN de la lignée MRC-5 n'est pas indiquée, bien qu'elle soit en quantité du même ordre de grandeur que celle contenue dans le Varivax américain. En tout cas, 2 microgrammes d'ADN fœtal de MRC-5 ne sont pas à mon avis une quantité résiduelle, mais un véritable composant du vaccin.

Les études in vitro du Dr Deisher, qui, nous l'espérons, seront publiées sous peu, montrent malheureusement des résultats déroutants lorsqu'un vaccin contenant de l'ADN humain fœtal (hypométhylé) est incubé in vitro avec des cellules souches hématopoïétiques humaines. Mais nous attendons la publication des recherches et nous pourrons ensuite nous retrouver sur le sujet.


Loretta Bolgan *

* Docteur en chimie et technologies pharmaceutiques, avec un doctorat en sciences pharmaceutiques de la Harvard Medical School Boston. Elle a travaillé dans le secteur de l'industrie pharmaceutique où elle s'est occupée de l'enregistrement et du développement de projets de recherche dans le domaine de l'oncologie. Consultant partie de la loi 210/92, pollution de l'environnement et maladies professionnelles, a participé à la dernière commission d'enquête parlementaire sur l'uranium appauvri dans le groupe des vaccins. Consultant actuel pour l'Ordre national des biologistes pour la toxicologie des médicaments et des vaccins, il s'occupe également de nutrition et de thérapies complémentaires.


Télécharger : CORVELVA-D.ssa-Loretta-Bolgan-rencontre-a-Bucci.pdf