סוף סוף כאן אנו - כמעט שנתיים - הפרסום הראשון שנבדק על ידי עמיתים על ניתוחים שלנו יוצא ורבים אחרים עומדים לצאת לאור.

מטרת מאמר זה היא לסכם את הנושאים הבאים: מה פורסם, מה תוקפו ומדוע חשוב לבדיקתנו בנושא חיסונים. כל הטיעונים הללו יטופלו בצורה עממית ולא טכנית בעמודים הראשונים, ואילו מעמוד 3 ואילך יתקיים מחקר טכני על מנת לאפשר למומחים של מגזר זה להעריך את המאמר בפני עצמו.

המאמר שפורסם ב- "F1000 Research"¹ היא תוצאת המחקר הראשוני שנערך על ידי אחת המעבדות שאותן מינה איגוד קורבלבה לביצוע הניתוחים. אנו מזכירים לכם - מכיוון שחלפו למעלה משנתיים מתחילת העבודה הזו ותוצאות רבות אחרות נוספו לראשונות - כי הנושא העיקרי הראשון שהיה עלינו לחקור היה הכמות הלא תקינה של ה- DNA האנושי שנמצא בתוך החיסונים שניתחו.

הניתוחים הראשונים הראו כי גם חיסוני ה- MMRV המשולשים שנבדקו מכילים 1 עד 2.7 מיקרוגרם / בקבוקון (כפי שפורסם במאמר הנוכחי) והחלטנו לדווח בפומבי ומיד על תוצאות כאלה מכיוון שפשוט לא היה צפוי שכמות כזו של DNA יכול להיות קיים בתוך חיסון.

מלבד השיקולים והמסקנות שהושג על ידי המחקר, שהם טכניים לחלוטין ולכן אפשר להבין אותם רק למי שעוסק בתחום המחקר המטגנומי, מה שנצפה בגרפים הוא ששתי דגימות החיסון מכילות אחוז גבוה של קריאות DNA אנושיות בנוסף לאלו הצפויים מגנום נגיף האבעבועות רוח (נגיף אלפא-הרפס אנושי 3), הניתן לגלות היחיד מבין ארבעה, כניתוח מסוג DNA שנצבר במאמר.

עם זאת, אנו רוצים לציין שכמויות ה- DNA שנמצאו ואושרו על ידי אותה שיטה שתוקף כעת כאן היו אפילו יותר גבוהים: עד 3.7 מיקרוגרם לבקבוקון, מה שמוביל להבדל ניכר בין אצווה לאצווה. למעשה, בדו"ח שלנו שפורסם ב- 22 בדצמבר 2018² דווח על התוצאות שהתקבלו מניתוח קבוצות שונות מאלו שנדונו במאמר הנוכחי, ואושרו לאחר מכן על ידי ניתוח בין-לשוני שעדיין נמצא בתהליך פרסום.

לפיכך, מה שיש לראות בו כעניין רב בפרסום הנוכחי הוא שהוא מאמת את השיטה בה השתמשנו, נותן נקודה חשובה לדיונים על "סוג" הניתוח שבוצע, וכתוצאה מכך זה מאשר באופן מוחלט את כל המחקרים שבוצעו לאחר מכן בשיטת NGS: הניתוח המעמיק על סוג החומר הגנטי, הימצאותם של וירוסים הרפתקנים, היעדרם הגדול של נגיפים מותחמים שצריכים להיות קיימים וכמות ה- DNA האנושי שהייתה לגמרי בשליטה (גם מכיוון ששונה מאוד מדגימה לדגימה) , האוכלוסייה המוטנטית, הפאגים, ה- DNA ממינים אחרים וכן הלאה. אתה יכול למצוא את aאני אמצא את התוצאות באתר האינטרנט שלנו³. 

 כל מה שהוקענו בשנים האחרונות, מנקודת מבט ביולוגית, הדיווח ביסודיות על התוצאות לגופי הפיקוח, מקבל קונוטציה מדעית רלוונטית יותר (גם אם נשוב על כך שוב, לא היו ביקורות העמיתים שהיו צריכות דאגה אך הנתונים שהוצגו, חמורים מאוד בתוכן שלהם וההשלכות האפשריות שלהם על בריאות האדם). עם זאת, כעת, לאחר שפרסום השיטה נעשה, אנו נדרוש את התשובות שטרם ניתנו לנו.

תוצאות אלו מאששות ללא עוררין את נוכחותו של DNA עוברי בחיסוני טטרה פריורייקס, בכמויות משתנות מאצווה לצוות, מה שמעיד על בקרת איכות ירודה של מוצרים תרופתיים אלה.

אנו גם רוצים להזכיר את הדיווח על כל רצפי הגנום של MRC-5 שפורסמו באתר קורבלבה ב- 27 בספטמבר 2019⁴  מראה את השינוי העמוק של ה- DNA הזה גם בגנים המקושרים להתפתחות מחלות גידולים (נתונים אלה יפורסמו בקרוב). ה- DNA העוברי המזהם שנמצא בכל הדגימות שניתחו בכמויות משתנות (כלומר לא מבוקרות) גבוה עד פי 300 מהמגבלה שהטילה ה- EMA על DNA מסרטן (10 ננוגרם / מנה, המקביל לדנ"א הכלול בכ -1000 תאים סרטניים, על בסיס חישוב סטטיסטי, בעוד שמגבלת הזהירות היא 100 pg / מנה), מגבלה שיש בהכרח להחיל גם על DNA עוברי המזהם בהכרח את חיסון ה- Priorix Tetra.

כתוצאה מכך יש לראות בחיסון פגום ובעל פוטנציאל מסוכן לבריאות האדם, במיוחד עבור אוכלוסיית הילדים הפגיעה הרבה יותר בנזק גנטי ואוטואימוני עקב חוסר בשלותן של מערכות החסינות.

 כצפוי, החלק הבא של המאמר הוא "טכני" וקשה יותר להבנה עבור אנשים שאינם מומחים, ולכן החלטנו, אפילו למטרות שקיפות, לצרף למסמך זה גם את "תיק EMA - תיק NGS דיון על תוצאות סקר איכות החיסון". היינו צריכים להחיש רק את החלק שניתן לפרסם, כלומר 50 עמודים של התיק לעומת 200 העמודים של ה- NGS, מכיוון שחלק גדול מהמידע הכלול ונרשם לגופי הרגולציה חייב להישאר חסוי. החוק המדעי הנוקשה מכתיב שניתן לפרסם פיסת מידע ביומן רק אם הוא מקורי ומכיוון שיש לנו עבודות אחרות בעיניינו, איננו רוצים לסכן אותו.

תיק EMA - NGS דיון על תוצאות סקר איכות החיסון ". https://bit.ly/342XKi7

לבסוף, כדי למנוע אי הבנות, ברצוננו להדגיש את החלק של "הצהרת מימון" מהפרסום שצוין לעיל:

"רצפי המטגנום B1 ו- B2 מומנו על ידי קורבלבה (העמותה, ונטו, איטליה) במסגרת חוזה שירות עם המעבדה. שום תרומה אחרת לא הייתה מעורבת בתמיכה בעבודה. למממנים לא היה תפקיד בעיצוב התכנון מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד "

מְצוֹרָף:

• פרסום - האם אתה חושק בי? השפעת הפחתת הכיסוי במחקרי רצף רובה ציד מטגניום
• CORVELVA-חוט-NGS-EMA-eng
• הפרסום הראשון שעבר ביקורת עמיתים בנושא חיסונים נגד MMRV (Priorix Tetra)

במאמר "האם אתה חושק בי? השפעת הפחתת הכיסוי במחקרי רצף רובה ציד מטגניום "

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

המחברים מתייחסים לשאלה הטכנית-מתודולוגית האם ניתן להשתמש בגישה מטגנומית מקבילה מאסיבית עם כיסוי קריאה נמוך כדי לאפיין מטריצות ביולוגיות מורכבות. הערכות של גיוון, שפע מינים והיכולת לשחזר את המטגנום דה נובו מבחינת האורך והשלמות מחושבים, על מנת להבין עד כמה הירידה בעומק הרצף, המגוונת על ידי קריאות רצף ברצף משנה באופן אקראי, עשויה להשפיע על התוצאות הסופיות. התוצאות מראות כי ניתן להעריך במדויק את מדדי הגיוון של קהילות פרוקריוטיות, אוקריוטיות ויראליות באמצעות 500,000 קריאות ומטה, אם כי דגימות מורכבות במיוחד עשויות לדרוש 1,000,000 קריאות. להפך, פרויקט הכולל שחזור המטגנום והגנים שהוא מכיל מכיל דורש יותר מ- 1,000,000 קריאות.

בין המטריצות המורכבות השונות והשונות מאוד זו מזו, הניתנות לניתוח מטגנומי מאסיבי, נכללו שתי תרופות ביולוגיות, כלומר שתי קבוצות שונות של חיסון MPRV חי מנוכי חי המשמשים לחיסון נגד חצבת, חזרת, אדמת ואבעבועות רוח אצל ילדים. DNA הוצא מהחיסונים, ספריות גנומיות נבנו באמצעות פרוטוקולים מסחריים סטנדרטיים ובוצע רצף מסיבי בטכנולוגיית Illumina.

מלבד השיקולים והמסקנות שהעבודה הגיעה, שהם טכניים בהחלט ולכן אפשר להבין אותם רק למי שעושה מחקר בתחום המטגנום, מה שנצפה בתרשימי העוגה הכלולים ב'נתונים מורחבים '(https://osf.io/wq395/ דגימות B1 ו- B2) הן ששני דגימות החיסון נמצאו ככמות של אחוז גבוה של קריאות DNA אנושיות בנוסף לאלו הצפויים מגנום של נגיף אבעבועות רוח (אנושי) אלפא הרפס וירוס 3), היחיד שניתן לזהות מבין הארבעהמאז הוצג במאמר ניתוח מסוג DNA-seq.

71% מהקריאות בקבוצה אחת ו 88% בשני הם ממקור אנושי, ככל הנראה נגזר מקו התאים העוברי MRC-5 (זכרו כי הניתוח שלאחר מכן אישר כי הקו הוא MRC5) בו נגיפי אדמת חי ומוחלש חיים. גדל במהלך הכנת החיסון. יתרה מזאת, כפי שקרה בקבוצות השונות של אותו חיסון MPRV שנבדק על ידי קורבלבה בין 2017 ל -2019, כמות ה- DNA שחולצה היא בסדר גודל של מיקרוגרם.

בקבוצות חיסונים שנבדקו באותה פרוטוקולים וטכנולוגיה המדווחות בחומרים ובשיטות של המאמר, הכמויות שהתגלו נעו בין 1 לכמעט 3 מיקרוגרם לבקבוקון, כמויות שונות בין קבוצות, אך תמיד משמעותיות.

B1 https://osf.io/86mbn/

B2 https://osf.io/dxayz/

בדו"ח שפרסם קורבלבה ב- 22.12.2018 ⁵התוצאות שלהלן דווחו עבור קבוצות נוספות שעברו ניתוח לאחר הנדון במאמר, ואושרו מאוחר יותר על ידי ניתוח משולב שעדיין נמצא בתהליך הפרסום.

פריוטריקס הרבה טטרה. A71CB205A (יוני 2018) - ניתוח DNA

פריוטריקס הרבה טטרה. A71CB256A (דצמבר 2018) - ניתוח DNA

ניתוח DNA

מדידת ריכוז ה- DNA עם פלואורומטר QuBit הראה כי המגרש A71CB205A מכיל בסך הכל 1.7 מיקרוגרם gDNA למינון 0.5 מיליליטר, מחושב כדלקמן: 9.41ng / μl (ריכוז שנקבע ב- QuBit) x 45 (נפח ההשהיה הסופי של ה- DNA לאחר החילוץ, מבוטא במיקרוליטר) x 4 (נפח ההתחלה המוגש להליך החילוץ הוא ¼ מנפח המינון הכלול בבקבוקון כולו של 0.5 מ"ל).

המדידה של ה-DNA ריכוז עם פלואומטר QuBit הראה כי A71CB256A הרבה מכיל סך הכל gDNA של 3.7 מיקרוגרם למינון של 0.5 מ"למחושב כדלקמן: 40.8 ng / μl (ריכוז שנקבע ב- QuBit) x 55 (נפח resuspension סופי של DNA לאחר מיצוי שבא לידי ביטוי במיקרוליטר) x 5/3 (נפח ההתחלה שהוגש להליך החילוץ הוא 300 μl על 500 μl של השעיה ).

ה- DNA האנושי שנמצא בקבוצה זו הוא בערך 8 עד 1 יחסית ל- DNA אבעבועות רוח (ראו את התוצאות הבאות לסיווג של שברי DNA-seq, המראים כי 88% מכלל שברי ה- DNA ברצף הם ממוצא אנושי, ו- 11% הם מגנום של נגיף אבעבועות רוח).

בהתחשב בכך ש- NGS היא טכנולוגיה כמותית, הכימות הפלואורימטרי של ה- DNA הכולל שחולץ מהחיסון (למשל, מגרש A71CB256A = 3.7 מיקרוגרם למינון), בשילוב עם השיקול של הכימות היחסי שנעשה למעלה (8: 1), מאפשר לנו לומר כי אנושי ה- DNA יכול להיות בערך 2.9 מיקרוגרם למינון, בהשוואה לכ- 740 ננוגרם של DNA אבעבועות רוח. זה גם מתקבל על הדעת לפחות חלק אחד מ- DNA המשקל המולקולרי הגבוה שנראה על ג'ל יכול להיות DNA אנושי במשקל מולקולרי גבוה.

ניתוח RNA

הכמות של רנ"א כלול בבקבוקון החיסון מגרש A71CB256A התברר כ- 200ng.

ה- RIN השווה ל 8 מציין א איכות מעולה RNA ו- RNA אקוקרוטי שלם, מכיוון ששיאי ה- 18S וגם 28S האופייניים ל- RNA האוקריוטי קיימים.

התשובות לשאלות שלנו שהועברו לסוכנויות הרגולציה לאורך זמן חשובות ביותר. נכון לעכשיו הסוכנויות טרם ענו על השאלות הנוגעות לתוצאות הניתוחים המלאים שהועברו ל- EMA ו- AIFA.

תמצית מהתגובה שנמסרה על ידי ה- EMA לשאלתנו בנוגע לבטיחות שאריות MRC-5 בחיסון הטריטר® Priorix® (התייחסות לבקשת EMA ask-43967 3 באוגוסט 2018) - "על סמך המידע שפורסם, Priorix® Tetra מכיל זנים ויראליים המיוצרים בנפרד בתאי עובר עוף (חזרת וחצבת) או בתאים דיפלואידים אנושיים MRC-5 (אדמת ואבעבועות רוח). קווי התאים המשמשים ל- Priorix® Tetra כוללים קווי תאים דיפלואידים אנושיים שלא יכולים להתחלק ברציפות. שים לב שלפי הפרמקופואה האירופית, קווי התאים הדיפולואידים של MRC-5 אינם גידוליים, כפי שמודגם על ידי עשרות שנים של שימוש ובקרה, ולכן הגבול המקסימאלי ל- DNA של תאי MRC-5 אינו חל "

נכון להיום, לא הובאו כל ראיות (לא מבחינת תעודות ניתוח לאיכות המוצר ולא לספרות מדעית בנושא EMA) של בקרות אלה המבטיחות כי ראוי שלא להחיל מגבלה מקסימאלית.

בהנחיית ה- FDA "הכוונה לתעשייה: אפיון והסמכה של מצע תאים וחומרים ביולוגיים אחרים המשמשים לייצור חיסונים נגיפיים לאינדיקציות למחלות זיהומיות".⁶ נאמר כי:

• זן של תאים דיפלואידים תמיד צריך להישאר דיפלואיד. אם מאפיינים אלה אינם יציבים, יש צורך להדגים כי חוסר יציבות אינו משפיע לרעה על ייצור המוצר או על התאמתו.
• עבור זני תאים דיפלואידים אנושיים הנמצאים בשימוש נרחב, כגון MRC-5 ו- WI-38, ייתכן שמדידת DNA שיורית אינה נחוצה מכיוון שאיננו רואים את ה- DNA השארי של תאים דיפלואידים אנושיים כנושא בטיחותי.
• יש להגביל את ה- DNA השארי לתאים רציפים שאינם מורכבים, כמו תאים אמיתיים עם מספר נמוך של מעברים, פחות מ -10 נ"ג / מנה לחיסון parenteral כפי שהומלצו על ידי ארגון הבריאות העולמי

והנחיה של ארגון הבריאות העולמי "נספח 3 - המלצות להערכת תרביות תאים מן החי כמצעים לייצור תרופות ביולוגיות ולאפיון בנקים תאים. החלפת נספח 1 לסדרת הדוחות הטכניים של ארגון הבריאות העולמית, n. 878 "מוסיף: (...) הצטבר ניסיון רב בתחום הציטוגנטיקה של WI-38 ו- MRC-5 מאז שנות השישים וכדי לתמוך בחוויה זו, המאמרים הבאים רשומים:

• ג'ייקובס ג'יי.פי. תוצאות מעודכנות בנושא הקריולוגיה של זני התאים WI-38, MRC-5 ו- MRC-9. התפתחויות בתקינה ביולוגית, 1976, 37: 155–156.
• ג'ייקובס ג'יי.פי. et al. הנחיות להתקבלות, ניהול ובדיקה של תאים דיפלואידים אנושיים המופצים באופן סדרתי לייצור חיסונים חיים נגד וירוסים לשימוש באדם. Journal of Biologic Standardization, 1981, 9: 331–342.
• Petricciani JC ואח '. תקני קריולוגיה לקו תאי דיפולואידי rhesus DBS-FRhL-2. Journal of Biologic Standardization, 1976, 4: 43–49.
• Scholmayer et al. ניתוח ברזולוציה גבוהה ועיבוי דיפרנציאלי בכרומוזומים אנושיים בעלי RBA. גנטיקה אנושית, 1981, 59: 187–193.
• הכנת Rønne M. כרומוזום וטכניקות רצועה גבוהה ברזולוציה: סקירה. Journal of Dairy Science, 1989, 72: 1363–1377.

ניתן לציין בבירור כי ספרות הייחוס הטוענת כי התאים הדיפלואידים המשמשים לייצור חיסונים בטוחים מבחינת היציבות הגנטית, מיושן. כבר לפני 40 שנה נמצאו החריגות הגנטיות הראשונות, שנחשבות זניחות לבטיחות החיסונים, וממה שמדווח בהנחיית WHO, מאז לא בוצעו עדכונים עם טכנולוגיות הרצף החדשות, בפרט ב- NGS, שהיא יתר על כן. כלכלית ומהירה, עם התוצאה שבחיסונים שניתנו במשך עשרות שנים הסוכנויות איפשרו נוכחות של DNA שהוחלף גנטית יותר ויותר בהדרגה ובכמויות בלתי מבוקרות. בנושא זה ראו את הדו"ח על רצף כל הגנום MRC-5 שפורסם באתר קורבלבה בתאריך 27.09.2019 בו שינוי עמוק של DNA זה ניכר גם בגנים הקשורים להתפתחות פתולוגיות גידולים. (נתונים שמתפרסמים)

להלן דווח על תמצית ממכתבו של ד"ר T. Deisher-מומחה עולמי לשימוש בתאי גזע למטרות טיפוליות ולטיפול גנטי- המדגיש את הדאגה מהסיכונים הכרוכים בשימוש בחיסונים המזוהמים עם שאריות תאי העובר האנושיים. :

ד"ר ט. דיישר (מכתב לנגידים - 8 באפריל, 2019) - (...) הזרקת ילדינו עם זיהום DNA עוברי אנושי טומנת בחובה את הסיכון לגרום לשתי פתולוגיות מאוחדות:

• מוטגנזה החדרת: DNA עוברי אנושי משולב ב- DNA של הילד הגורם למוטציות. טיפול בגנים באמצעות שילוב של שברים קטנים הומולוגיים הראה שכמויות קטנות כמו 1.9 ng / mL של שברי DNA גורמות להחדרת תאי גזע לגנום ב 100% מהעכברים שהוזרקו. רמות שברי ה- DNA העוברי האנושי בילדינו לאחר חיסון עם MMR, VARIVAX (אבעבועות רוח) או חיסון נגד צהבת A מגיעים לרמות העומדות על 1.9 נ"ג / מ"ל.
• מחלה אוטואימונית: DNA אנושי עוברי מגרה את התגובה של המערכת החיסונית לתקוף את גופו של הילד.

התוצאות שלנו מחזקות מאוד את תצפיות הניסוי של ד"ר דירשר, מעל לכל העובדה כי ה- DNA העובר המזוהם שנמצא בכל הדגימות שניתחו בכמויות משתנות (ולכן לא מבוקר) הוא גבוה פי 300 מהגבול שהטיל ה- EMA עבור ה- DNA המסרטני (10 נ"ג / מנה, המתאימים ל- DNA הכלול בכ -1000 תאים סרטניים, המתקבלים על בסיס חישוב סטטיסטי, בעוד שהמגבלה המונעת זהירה היא 100 pg / מנה) מגבלה שיש בהכרח להחיל גם על DNA עוברי המזהם בהכרח את Priorix® טטרה.

לפיכך, יש לראות בחיסון זה פגום ובעל פוטנציאל מסוכן לבריאות האדם, בפרט באוכלוסיית הילדים הפגיעה הרבה יותר בנזק גנטי ואוטואימוני עקב חוסר בשלות במערכות התיקון.

1. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
2. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate.html
   https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate-en.html
3. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/
5. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
6. https://www.federalregister.gov/documents/2010/03/04/2010-4553/guidance-for-industry-characterization-and-qualification-of-cell-substrates-and-other-biological