השוואה בין הגנום האנושי הכלול ב- Priorix Tetra ובקו התאים MRC-5

השוואה בין הגנום האנושי הכלול ב- Priorix Tetra ובקו התאים MRC-5

הצגת בקצרה של התוצאות

אנו מציגים היום מחקר נוסף וחשוב מאוד על הרצף הגנומי של קו התא שנמצא בתוך החיסון הרביעי MPRV (חצבת, אדמת, חזרת ודליות) פריוארס טטרה, וזה של קו התא MRC-5 (שהוא זה שהוכרז בשימוש בפיתוח התאי החיסון עצמו).

סיכום הדו"חות הקודמים שפורסמו: 

  1. הדגמנו לראשונה כיצד כמות ה- DNA הקיימת בחיסון הנ"ל היה הרבה מעל המותר;  
  2. לאחר מכן בדקנו כי קו התא הוא למעשה ה- MRC-5 המוצהר
  3. בהמשך המשכנו רצף גנום של קו התא המופק ישירות מהחיסוןתוך הדגשת מוטציות כבדות מאוד שיש בהן אפשרות לסיכונים בריאותיים חמורים בשימוש בחיסון זה.

מה שאנחנו מציגים כאן הוא בדיוק עבודת ההשוואה בין שני הגנומים: מה שמצאנו באמת בחיסון וזה של ה- MRC-5 שנרכש ממסד הנתונים של ATCC.

התוצאה היא ששני הקווים מציגים הבדלים חשובים מבחינת היציבות הגנטית. בפרט נראה כי גנום החיסון השתנה מאוד בהשוואה לזה של קו התא שהופקד בשנת 1966.

המשמעות היא שהמפיקים, במקרה זה של הטריוטר פריוריוס, רכשו את קו התא בתנאים אופטימליים מנקודת המבט של יציבות גנטית ועם שימוש רציף לאורך זמן לצורך הייצור הציגו לשוק חיסונים המכילים חומר גנטי אנושי בהדרגה. יותר ויותר מסוכנת לבריאות החוסנים. 

מכיוון שסוכנויות הרגולציה אינן דורשות בקרה תקופתית ביציבות הגנטית של קווי העובר ואף אינן קובעות סף בטיחות מינימלי, אנו יכולים להסיק כי דרישה בסיסית לאיכות ובטיחות החיסונים שהיו שהושג מקווי תאים אנושיים, כלומר הצורך לוודא כי הם אינם רוכשים מוטציות וסידור מחדש שעלולים להיות מסוכנים ולהבטיח את ביטול שאריות העיבוד של חומר גנטי אם קיימים.

לא עלינו לזהות איזה חלק מתהליך הייצור או השימור יכול להשפיע על איכות ובטיחות המוצר, אך מה שנוכל להעיד היום על ידי פרסום דוח זה הוא שדחוף לגופי הבקרה לבצע בחינה מעמיקה של התוצאות שהניתוחים שלנו הדגישו. בשנתיים אלה, תוך התמקדות במוצר המוגמר, שנמכר ומנוהל ולא רק ב"מרכיבים "המורשים.

זכור שוב שמוצרים אלה הם חלק מלוח החיסונים האיטלקי והם מנוהלים כיום בכפייה לאוכלוסיית הילדים במדינה שלנו כמו גם למדינות אחרות באירופה ובכלל בכל רחבי העולם.

לגופי הפיקוח יש אחריות עצומה לבטיחות שמבשרת כעת במילים, אך למעשה, וכפי שנראה מהניתוחים שלנו, אי אפשר להבטיח אותה ואכן מתעלמת ממנה באופן ברור.


הדמיה מעגלית של גנום (עלילת קרקס)

להלן ייצוג גרפי של שני הגנומים הנקראים 'עלילת קרקס'.

5. corvelva mrc1 XNUMX

משמעות המעגלים המרוכזים השונים

  1. המעגל החיצוני (המעגל הראשון) הוא מספר הכרומוזום.
  2. הטבעת השנייה (כחולה) מייצגת את הכיסוי של קריאות בסגנון היסטוגרמה. כל היסטוגרמה היא הכיסוי הממוצע של שטח של 0,5 Mbp.
  3. הטבעת השלישית (שחור) מייצגת את צפיפות ה- INDELs בסגנון 'גרף פיזור'. כל נקודה שחורה מחושבת כמספר INDEL (הכנסות / מחיקות קטנות) בטווח של 1 מגהבייט לשנייה.
  4. הטבעת הרביעית (ירוקה) מייצגת את ה- snp בצפיפות בסגנון 'גרף פיזור'. כל נקודה ירוקה מחושבת כמספר ה- SNPs (גרסאות גרעין בודדות) בטווח של 1 מגהבייט לשנייה.
  5. הטבעת החמישית מייצגת את החלק של הומוזיגוזיות (כתומה) והטרוזיגוזיות (אפורה) SNP בסגנון היסטוגרמה. כל היסטוגרמה מחושבת מאזור של 1 מגהבייט.
  6. הטבעת השישית מייצגת את מסקנת ה- CNV (וריאנטים במספר עותקים). אדום פירושו להשיג חלקי DNA וירוק פירושו אובדן.
  7. הטבעת המרכזית ביותר מייצגת את ההיקף של SV (גרסאות מבניות) באזורים האקזוניים והשחבוריים. בין (כתום, טרנסלוקציות), INS (ירוק, הכנסות), DEL (מחיקות, אפור), DUP (כפילויות, ורוד) ו- INV (היפוכים, כחול).

מסקנות

שני הגנומים מראים הבדלים חשובים. בפרט, גנום החיסון מתברר כי הוא השתנה מאוד בהשוואה לזה של קו התאים שהופקד בשנת 1966. יש לומר שלא הייתה לנו אפשרות לרצף את קו התא שמשמש GlaxoSmithKline לייצור החיסון Priorix Tetra, אלא זה של המניה מקורי. לחברות התרופות המשתמשים בקווי תאים לייצור תרופות וחיסונים יש קו MRC-5 שלהן אך זה לא משנה את החשדות שלנו, כלומר העובדה שבקרת יציבות גנטית אינה נדרשת מעת לעת וזה מאוד חמור לדעתנו , יותר מכל משום שמותר להיות נוכח ללא גבול.


הורדה: CORVELVA-השוואה-אנושי-גנומי Priorix-טטרה-ו-קו-MRC-5.pdf


השוואה בין הגנום האנושי הכלול ב- Priorix Tetra ובקו התא MRC-5 (תקן ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

נוכחות נגיף האדמת הודגמה על ידי רצף של ספריית RNA-seq עמוקה במיוחד (כ- 260 מיליון רצפי Illumina שהופקו). 114 מתוך 260 מיליון רצפים אותרו, שווים ל- 0.00004% מכלל הרצף. לאחר מכן אושרו רצפי הגנום של האדמת ידנית באמצעות תוכנת BLAST (כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). הספרייה המורצבת בעומק נמוך יותר (כ -12 מיליון רצפים מצורפים של אילומינה, שווים ל -6 מיליון שברי ספריה רצופים) לא גילתה את נוכחותם של כל קריאה המיוחסת לאדמת במגרש זה.

גם רצפי הנגיפים האחרים שנמצאים בחיסון (אבעבועות רוח, חצבת וחזרת) אושרו באותה דרך ידנית, ואשרו כי הוקצו להם כראוי.


מבוא

רצפי הדור החדש הפכו לכלים לבחירה לניתוחים מעמיקים בתחום הביולוגיה והרפואה, ובעיקר לדייקנות זו. כלים אלה מאפשרים גישה חדשה וגלובלית יותר לסדרת יישומים כמו רצף דה-נובו, מטגנומיקה, אפיגנום, רצף טרנסקריפט ורצף מחדש של הגנום.

יישום אחרון זה (רצף מחדש) נפוץ מאוד בתחום האנושי הן למטרות מחקר והן לצורך אבחון והוא מורכב ברצף עם טכנולוגיית NGS (Next Generation Sequencing) של גנום אינדיבידואלי שלם על מנת למפות מוטציות של נוקלאוטידים יחידים (SNP, "הגייה" של ההגייה) '), הכנסות ומחיקות של רצפים ארוכים פחות או יותר התרחשו במיקומים מסוימים של הגנום וריאציות במספר העותקים של חלקים מגנום / גנים (CNV, Copy Number Variants).

הליך הרצף דורש כי ה- DNA של הפרט יתפרק באופן מכני לשברים קטנים (400-500 זוגות בסיס) ושברים של דרכי DNA מלאכותיות הנקראים מתאמים נקשרים לשברים המאפשרים לקשור את שברי ה- DNA האנושי ל משטח זכוכית שעליו נקראים הבסיסים (A, C, G, T). בסיסי ה- DNA נקראים על ידי שילוב תגובות כימיות של נוקלאוטידים המסומנים במולקולות פלואורסצנטיות. לאחר מכן ממפים את מיליוני הרצפים (קריאות) המתקבלים מרצף על משטח הזכוכית על הגנום של הייחוס האנושי בעזרת תוכנה מתאימה ואז מזוהים כל הגרסאות הקיימות בגנום המנותח בהשוואה להפניה.

הליך זה בוצע על הגנום האנושי שנמצא במגרש ה- Priorix Tetra. n. A71CB256A ועל ה- DNA שחולץ מקו התא MRC-5, הופקדו בשנת 1966 ב- ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC הוא הארגון המוביל בעולם של משאבי תקנים וחומרים ביולוגיים שתפקידם מתמקד ברכישה, אימות, ייצור, אחסון, פיתוח והפצה של מיקרואורגניזמים התייחסות, קווי תאים וחומרים ביולוגיים סטנדרטיים אחרים. היא הוקמה בשנת 1925, כאשר ועדת מדענים הכירה בצורך באוסף ריכוזי של חומרים ביולוגיים שיכול לשרת מדענים ברחבי העולם.

קו התא MRC-5 נגזר מרקמת ריאה רגילה מעובר זכר בן 14 שבועות והופקד ב- ATCC על ידי ג'ייפ ג'ייקובס בספטמבר 1966. על פי התאים, מדובר בתאים המסוגלים להכפיל 42-46 אוכלוסיות לפני תחילתם. של הוותק. מאמר ההתייחסות לקו תאים זה משנת 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0


 

תוצאות

כפי שהוצג בעבר, ה- DNA האנושי שנמצא במגרש ה- Priorix Tetra. n. A71CB256A (המצוין בגרפים הבאים כדוגמה ID12051PT) הוא גנום אינדיבידואלי שלם, כלומר יש DNA גנומי של כל הכרומוזומים של אדם גברי. גרפי הכיסוי (עומק ממוצע = כיסוי ממוצע) של 22 הכרומוזומים האנושיים וכרומוזומי ה- X ו- Y מוצגים להלן, עבור החיסון (תמונה למעלה) וקו התא MRC5 (תמונה למטה).

5. corvelva mrc1 XNUMX

תוצאות הניתוח של סוגים שונים של גרסאות מוצגות להלן.


גרסאות גרעין בודדות (SNP) ותוספות / מחיקות קצרות (InDels)

הווריאציות של בסיסי DNA יחידים (SNP, מבוטא 'צלף') הם פולימורפיזם, כלומר וריאציות של החומר הגנטי, הנישא על ידי נוקלאוטיד בודד. לעומת זאת, ה- 'InDels' הם הכנסות ומחיקות קטנות באורך של פחות מ- 50bp ומהווים סוג אחר של גרסאות גנומיות בגנום האנושי.

SNP (גרסאות גרעין בודדות) - ID12051PT

5. corvelva mrc1 XNUMX


SNP (גרסאות גרעין בודדות) - MRC-5

5. corvelva mrc1 XNUMX


INDELs (הכנסות / מחיקות קטנות) - ID12051PT

5. corvelva mrc1 XNUMX


INDELs (הכנסות / מחיקות קטנות) - MRC-5 

5. corvelva mrc1 XNUMX


CNV (גרסאות מספר העתקה) ו- SV (גרסאות מבניות)

וריאנטים במספר עותקים (CNV) הם גרסאות גנומיות עקב וריאציות במספר העותקים של שברים גדולים יחסית (יותר מ -50 bp) בין גנים בודדים. ישנם שני סוגים של CNV: סוג 'רווח' (רווח עותק) וסוג 'הפסד' (אובדן עותקים).

וריאציות מבניות (SVs) הן וריאציות גנומיות בעלות ממדים גדולים יחסית (> 50 bp), כולל מחיקות, כפילויות, הכנסות, היפוכים וטרנסלוקציות.

CNV (וריאציות במספר עותקים)

5. corvelva mrc1 XNUMX

5. corvelva mrc1 XNUMX


SV (גרסאות מבניות)

5. corvelva mrc1 XNUMX5. corvelva mrc1 XNUMX


הדמיה מעגלית של גנום (עלילת קרקס)

להלן ייצוג גרפי של שני הגנומים הנקראים 'עלילת קרקס'.

5. corvelva mrc1 XNUMX

5. corvelva mrc1 XNUMX


משמעות המעגלים המרוכזים השונים

  1. המעגל החיצוני (המעגל הראשון) הוא מספר הכרומוזום.
  2. הטבעת השנייה (כחולה) מייצגת את הכיסוי של קריאות בסגנון היסטוגרמה. כל היסטוגרמה היא הכיסוי הממוצע של שטח של 0,5 Mbp.
  3. הטבעת השלישית (שחור) מייצגת את צפיפות ה- INDELs בסגנון 'גרף פיזור'. כל נקודה שחורה מחושבת כמספר INDEL (הכנסות / מחיקות קטנות) בטווח של 1 מגהבייט לשנייה.
  4. הטבעת הרביעית (ירוקה) מייצגת את ה- snp בצפיפות בסגנון 'גרף פיזור'. כל נקודה ירוקה מחושבת כמספר ה- SNPs (גרסאות גרעין בודדות) בטווח של 1 מגהבייט לשנייה.
  5. הטבעת החמישית מייצגת את החלק של הומוזיגוזיות (כתומה) והטרוזיגוזיות (אפורה) SNP בסגנון היסטוגרמה. כל היסטוגרמה מחושבת מאזור של 1 מגהבייט.
  6. הטבעת השישית מייצגת את מסקנת ה- CNV (וריאנטים במספר עותקים). אדום פירושו להשיג חלקי DNA וירוק פירושו אובדן.
  7. הטבעת המרכזית ביותר מייצגת את ההיקף של SV (גרסאות מבניות) באזורים האקזוניים והשחבוריים. בין (כתום, טרנסלוקציות), INS (ירוק, הכנסות), DEL (מחיקות, אפור), DUP (כפילויות, ורוד) ו- INV (היפוכים, כחול).

מסקנות

שני הגנומים מראים הבדלים חשובים. בפרט, גנום החיסון מתברר כי הוא השתנה מאוד בהשוואה לזה של קו התאים שהופקד בשנת 1966. יש לומר שלא הייתה לנו אפשרות לרצף את קו התא שמשמש GlaxoSmithKline לייצור החיסון Priorix Tetra, אלא זה של המניה מקורי. לחברות התרופות המשתמשים בקווי תאים לייצור תרופות וחיסונים יש קו MRC-5 שלהן אך זה לא משנה את החשדות שלנו, כלומר העובדה שבקרת יציבות גנטית אינה נדרשת מעת לעת וזה מאוד חמור לדעתנו , יותר מכל משום שמותר להיות נוכח ללא גבול.