פרסום סקירת עמיתים ראשון בנושא חיסונים ל- MPRV (Priorix Tetra)

פרסום סקירת עמיתים ראשון בנושא חיסונים ל- MPRV (Priorix Tetra)

סוף סוף אנחנו שם, אחרי כמעט שנתיים הפרסום הראשון בסקירת עמיתים בניתוחים שלנו יוצא ורבים אחרים יבואו בעקבותיו.

כאן אנו מנסים לסכם בעמודים ראשונים אלה, בצורה מאוד דיסקורסאלית ולא טכנית: מה פורסם, איזה תוקף יש ומדוע חשוב לבדיקת החיסונים שלנו. 

(לעומת זאת העמודים 3 עד XNUMX מוקדשים למחקר טכני, ומשאירים את הערכת המאמר עצמו לעובדים במגזר)

מה שפורסם ב"מחקר F1000 " 1 זו תוצאה של החלק הראשוני של העבודה שבוצעה מטעם איגוד קורבלבה על ידי אחת המעבדות האחראיות על הניתוחים. כזכור - מכיוון שחלפו למעלה משנתיים מתחילת העבודה הזו ותוצאות רבות אחרות נוספו לתוצאות הראשוניות - הנושא העיקרי הראשון שמצאנו שאנחנו צריכים לחקור היה הכמות הלא תקינה של ה- DNA האנושי שנמצא בחיסונים שניתחו. 

בשני חיסוני ה- MPRV הרבעים שנבדקו, נמצאו בתחילה כמויות של 1 עד 2,7 מיקרוגרם / בקבוקון (לפי הפרסום המדובר), והדבר הוביל אותנו לדווח באופן פומבי ומייד על תוצאה זו מכיוון שפשוט לא היה צפוי כי כמות DNA זו הייתה קיימת בחיסון.

מלבד השיקולים והמסקנות שאליהן מגיעה העבודה, שהן טכניות לחלוטין ולכן מובן רק למי שעוסק במחקר בתחום המטגנום, מה שנצפה בגרפים הוא ששני דגימות החיסון נמצאו כמכילות אחוז גבוה של קריאות של DNA אנושי בנוסף לאלו הצפויים מגנום של נגיף אבעבועות רוח (נגיף אלפא הרפס אנושי 3), ניתן לגלות רק מבין הארבעהכפי שהוצג במאמר ניתוח רווח DNA.
עם זאת, אנו רוצים להדגיש כי בהמשך כמויות ה- DNA שנמצאו ואושרו באותה המידה שיטה שתוקף כעת כאן היו אפילו גבוהים יותר: עד 3,7 מיקרוגרם לכל בקבוקון, מה שהוביל להבדל משמעותי בין אצווה לאצווה.
למעשה, בדוח שלנו שנחשף בתאריך 22.12.2018 2 דווח על תוצאות עבור חלקים נוספים שניתחו לאחר אלה שנדונו במאמר, אושר עוד יותר על ידי ניתוחים משולבים שעדיין מתפרסמים. 

לכן, מה שהכי מעניין אותנו בפרסום זה הוא שהוא מאמת את השיטה בה נעשה שימוש, שם נקודה חשובה לדיונים על "סוג" הניתוחים שנערכו, וכתוצאה מכך מאשר באופן מכריע את כל העבודות שנעשו לאחר מכן בשיטת NGS: התובנות על סוג החומר הגנטי הכלול, הימצאותם של וירוסים הרפתקנים, היעדרם הגדול של נגיפים מנוכחים שצריכים להיות במקום והכמות במקום לצאת מכלל שליטה (גם בגלל שהיא שונה מאוד מדגימה לדגימה) של ה- DNA האנושי הקיים, האוכלוסייה המוטנטית , פאגים, DNA ממינים אחרים, ובהדרגה את כל התוצאות שתמצאו בסיכום באתר שלנו. 3

כל מה שמנקודת מבט של תוכן ביולוגי, הוקענו בשנים האחרונות, תוך דיווח סלבי לגוף הבקרה על התוצאות, מקבל קונוטציה מדעית רלוונטית יותר (גם אם אנו חוזרים ומדגישים זאת, לא היו ביקורות העמיתים שצריכו לדאוג. אך הנתונים שהוצגו, רציניים מאוד בתוכנם ובהשלכותיהם האפשריות על בריאות האדם). עם זאת, כעת, לאחר פרסום השיטה, אנו נדרוש לקבל את התשובות שטרם הגיעו.

תוצאות אלה מאששות באופן חד משמעי את נוכחותו של DNA עוברי בחיסוני הטריאטה פריורייקס, בכמויות המשתנות בין האצוות השונות, מה שמעיד על בקרת איכות ירודה של מוצרים תרופתיים אלה. 

אנו נזכרים גם בדו"ח על רצף כל הגנום MRC-5 שפורסם באתר קורבלבה ב- 27.09.2019 4 בו ניכר השינוי העמוק של DNA זה גם בגנים הקשורים להתפתחות פתולוגיות של גידולים (נתונים אחרים שמתפרסמים).

ה- DNA העוברי המזהם שנמצא בכל הדגימות שניתחו בכמויות משתנות (ולכן לא מבוקר) גבוה פי 300 מהגבול שנקבע על ידי ה- EMA ל- DNA מסרטני (10 ng / מנה, התואם ל- DNA הכלול בכ -1000 תאים סרטניים, המתקבל על בסיס חישוב סטטיסטי, בעוד שהמגבלה המונעת זהירה היא מגבלת 100 pg / dose) שיש בהכרח להחיל גם על ה- DNA העוברי שמזהם בהכרח את ה- Priorix Tetra.

מכאן עולה כי חיסון זה חייב להיחשב פגום ובעל פוטנציאל מסוכן לבריאות האדם, בפרט באוכלוסיית הילדים הפגיעים הרבה יותר לנזק גנטי ואוטואימוני עקב חוסר בשלות במערכות המקלט.

כצפוי, להלן אנשים "טכניים" וקשים להבנה עבור אנשים שאינם אנשי מקצוע, ולכן החלטנו, גם לשקיפות, לצרף למסמך זה גם את "תיק EMA - NGS דיון בתוצאות שהתקבלו מסקר איכות החיסון". נאלצנו רק להחיש את החלק שנחשף, יותר מ- 50 עמודים של תיקים לעומת 200 של ה- NGS, מכיוון שחלק גדול מהמידע הכלול ונרשם בגופי הרגולציה חייב להישאר חסוי. החוק המדעי הקשה מחייב לפרסם נתונים במגזין רק אם הם לא פורסמו ואנחנו, לאחר שיש כמה פרסומים אחרים בעיצומם, לא רוצים לסכן אותם.

 לבסוף, כדי למנוע אי הבנה, אנו רוצים להזכיר, מתוך הפרסום, את החלק של "הצהרת המימון": 

"רצף המטגנום B1 ו- B2 מומן על ידי Corvelva (העמותה, ונטו, איטליה), כחלק מחוזה שירות עם המעבדה. אף תרומה אחרת לא הייתה מעורבת בתמיכה ביצירה. למממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה לפרסם או בהכנת כתב היד. "

קבצים מצורפים:


במאמר "האם אתה חושק בי? השפעת הפחתת הכיסוי במחקרי רצף רובה ציד מטגניום "

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

המחברים מתמודדים עם השאלה הטכנית-מתודולוגית האם ניתן להשתמש בגישה מקבילה של מטגנומיקה במקביל עם כיסוי קריאה נמוך כדי לאפיין מטריצות ביולוגיות מורכבות. אומדנים למגוון, לשפע המינים והיכולת לשחזר את metagenome דה נובו מבחינת אורך ושלמות מחושבים, כדי להבין עד כמה יכולה הירידה בעומק הרצף, המשתנה על ידי דגימת משנה אקראית של קריאת הרצף, יכולה להיות התוצאות מראות כי ניתן לאמוד במדויק את מדדי המגוון של קהילות מורכבות פרוקריוטיות, אוקריוטיות וויראליות עם 500.000 קריאות או פחות, אם כי דגימות מורכבות במיוחד עשויות לדרוש 1.000.000 קריאות. נהפוך הוא, פרויקט הכרוך בשחזור המטגנום והגנים שהוא מכיל דורש יותר מ -1.000.000 קריאות.

בין המטריצות המורכבות השונות והמגוונות ביותר שעברו ניתוח מטגנומי מאסיבי, נכללו שתי תרופות ביולוגיות, כלומר שני חלקים שונים של חיסון MPRV מנוכי חי המשמשים לחיסון נגד חצבת, חזרת, אדמת ואבעבועות רוח בילדים. DNA הוצא מהחיסונים, לאחר מכן נבנו ספריות גנומיות באמצעות פרוטוקולים מסחריים סטנדרטיים ובוצע רצף מסיבי בטכנולוגיית Illumina.

מלבד השיקולים והמסקנות שאליהן מגיעה היצירה, שהם טכניים בהחלט ולכן אפשר להבין אותם רק למי שעושה מחקר בתחום המטגנום, מה שנצפה בתרשימי העוגה הכלולים ב'נתונים מורחבים '(https://osf.io/wq395/ דגימות B1 ו- B2) היא ששתי דגימות החיסון נמצאו מכילות אחוז גבוה של קריאות DNA של בני אדם בנוסף לאלה הצפויות מהגנום של נגיף הווריצלה (וירוס האלפאפרס האנושי 3), היחיד שניתן לזיהוי מבין הארבעה. הוצג ניתוח מסוג DNA-seq. 

71% מהקריאות בקבוצה אחת ו 88% בשני הם ממקור אנושי, ככל הנראה נובעים מקו התא ממוצא עוברי MRC-5 (זכור כי ניתוחים הבאים אישרו כי הקו הוא MRC5) שבהם נגרמים נגיפי אדמת חי ואיבול אבעבועות חיים במהלך הכנת החיסון. יתרה מזאת, כפי שקרה במגרשים השונים של אותו חיסון MPRV שנבדק על ידי קורבלבה בין 2017 ל -2019, כמות ה- DNA המופק היא בסדר גודל של המיקרוגרם. 

במגרשי החיסונים שנבדקו באותה פרוטוקולים וטכנולוגיה המדווחים בחומרים ובשיטות של המאמר, הכמויות שהתגלו נעו בין 1 לכמעט 3 מיקרוגרם לבקבוקון, כמויות שונות בין אצווה אחת לאחרת, אך תמיד משמעותיות

corvelva mprv1

B1 https://osf.io/86mbn/

corvelva mprv1

B2 https://osf.io/dxayz/

בדוח שנחשף על ידי קורבלבה בתאריך 22.12.2018 דווח על התוצאות הבאות חלקים נוספים שניתחו לאחר אלה שנדונו במאמראושר עוד יותר על ידי ניתוח בין-לשני שעדיין מתפרסם: 

פריוטריקס הרבה טטרה. A71CB205A (יוני 2018) - ניתוח DNA

corvelva mprv3

פריוטריקס הרבה טטרה. A71CB256A (דצמבר 2018) - ניתוח DNA

corvelva mprv3

ניתוח DNA

מדידת הריכוז של ה-DNA עם פלואורומטר QuBit הראה שמגרש A71CB205A מכיל כמות של 1.7 מיקרוגרם gDNA סה"כ לכל מינון 0.5 מ"ל, מחושב כדלקמן: 9.41ng / μl (ריכוז נקבע ב- QuBit) x 45 (נפח ההחייאה הסופי של DNA לאחר מיצוי, מבוטא במיקרוליטר) x 4 (נפח ההתחלה הנתון להליך החילוץ הוא ¼ נפח המינון הכלול בבקבוקון כולו שווה 0.5 מ"ל).

מדידת הריכוז של ה-DNA עם פלואורומטר QuBit הראה שמגרש A71CB256A מכיל כמות של gDNA של 3.7 מיקרוגרם בסך הכל למינון של 0.5 מ"למחושב כדלקמן: 40.8 ng / μl (ריכוז שנקבע ב- QuBit) x 55 (נפח resuspension סופי של DNA לאחר מיצוי שבא לידי ביטוי במיקרוליטר) x 5/3 (נפח ההתחלה הנתון להליך החילוץ הוא 300 μl מתוך 500 μl של השעיה).

ל- DNA האנושי שנמצא במגרש זה יחס יחסי של בערך 8 ל- 1 לעומת ה- DNA של אבעבועות רוח (ראו תוצאות הבאות לסיווג שברי ה- DNA-seq, בהן עולה כי 88% מסך כל שברי ה- DNA המורצבים הם של מוצא אנושי, ו- 11% הם מגנום נגיף הדליות). בהתחשב בעובדה שה- NGS הוא טכנולוגיה כמותית, הכימות הפלואורימטרי של ה- DNA הכולל שחולץ מהחיסון (למשל, חלק. A71CB256A = 3,7 מיקרוגרם במינון), הקשורים לשיקול הכימות היחסי שנעשה למעלה (8: 1), מאפשר לנו לומר ש- DNA אנושי יכול להיות בסביבה 2,9 מיקרוגרם למינוןבהשוואה לכ- 740 ננוגרם של DNA אבעבועות רוח. זה גם מתקבל על הדעת לפחות חלק מה- DNA המשקל המולקולרי הגבוה שנראה על ג'ל עשוי להיות ה- DNA האנושי במשקל מולקולרי גבוה.

ניתוח RNA

כמות רנ"א נמצא בבקבוקון של מגרש החיסון A71CB256A ככמעט 200ng.

ה- RIN השווה ל -8 מעיד על RNA באיכות מעולה ועל RNA אוקאריוטי שלם, מכיוון ששתי השיא 18S ו- 28S האופייניות ל- RNA האוקריוטי קיימות.

לתשובות לשאלותינו שהועברו לרשויות הרגולטוריות לאורך זמן יש חשיבות רבה. נכון לעכשיו, הסוכנויות טרם ענו על השאלות הנוגעות לתוצאות הניתוחים המלאים שהועברו ל- EMA ו- AIFA.

קטע מתשובת ה- ema לשאלתנו בנוגע לבטיחות שאריות mrc-5 בחיסון הטריטריקס פרייו (התייחסות לבקשת EMA ask-43967 3 אוגוסט 2018) - בהתבסס על המידע שפורסם, Priorix Tetra מכיל זנים ויראליים המיוצרים בנפרד בתאי עובר עוף (חזרת וחצבת) או בתאים דיפלואידים אנושיים MRC-5 (אדמת ואבעבועות רוח). קווי התאים המשמשים ל- Priorix Tetra כוללים קווי תאים דיפלואידים אנושיים שלא יכולים להתחלק ברציפות. שימו לב כי על פי הפרמקופואה האירופית, קווי תאים דיפלואידים MRC-5 אינם טומגניים, כפי שהוכח על ידי עשרות שנים של שימוש ובקרה, ולכן גבול מקסימאלי ל- DNA של תאי MRC-5 אינו חל "

עד כה לא הובאו כל ראיות (לא מבחינת תעודות ניתוח על איכות המוצר, וגם לא על ספרות עיון מדעית ל- EMA) של בקרות אלה המבטיחות כי ראוי לא להחיל מגבלה מקסימאלית.

בהנחיית ה- FDA "הכוונה לתעשייה: אפיון והסמכה של מצע תאים וחומרים ביולוגיים אחרים המשמשים לייצור חיסונים נגיפיים לאינדיקציות למחלות זיהומיות". 6 דווח כי:

  • זן של תאים דיפלואידים תמיד צריך להישאר דיפלואיד. אם מאפיינים אלה אינם יציבים, יש צורך להדגים כי חוסר יציבות אינו משפיע לרעה על ייצור המוצר או התאמתו.
  • עבור זני תאים דיפלואידים אנושיים הנמצאים בשימוש נרחב, כגון MRC-5 ו- WI-38, ייתכן שמדידה של DNA שיורי אינה נחוצה מכיוון שאנו לא רואים את ה- DNA השארי של תאים דיפלואידים אנושיים כנושא בטיחותי.  
  • יש להגביל את ה- DNA השארי לתאים רציפים שאינם מורכבים, כמו תאי VERO נמוכים עוברים, פחות מ 10 נ"ג / מנה לחיסון parenteral כמומלץ על ידי ארגון הבריאות העולמי

ובהנחיה של ארגון הבריאות העולמי "נספח 3 - המלצות להערכת תרביות תאים מן החי כמצעים לייצור תרופות ביולוגיות ולאפיון בנקים תאים. החלפת נספח 1 לסדרת הדוחות הטכניים של ארגון הבריאות העולמית, n. 878 " 7 נוסיף: (...) ניסיון רב נצבר בתחום הציטוגנטיקה של WI-38 ו- MRC-5 מאז שנות ה -60

וכדי לתמוך בחוויה זו, המאמרים הבאים רשומים:

  • ג'ייקובס ג'יי.פי. תוצאות מעודכנות בנושא הקריולוגיה של זני התאים WI-38, MRC-5 ו- MRC-9. התפתחויות בתקינה ביולוגית, 1976, 37: 155–156.
  • ג'ייקובס ג'יי.פי. et al. הנחיות להתקבלות, ניהול ובדיקה של תאים דיפלואידים אנושיים המופצים באופן סדרתי לייצור חיסונים חיים נגד וירוסים לשימוש באדם. Journal of Biologic Standardization, 1981, 9: 331–342.
  • Petricciani JC ואח '. תקני קריולוגיה לקו תאי דיפולואידי rhesus DBS-FRhL-2. Journal of Biologic Standardization, 1976, 4: 43–49.
  • Scholmayer et al. ניתוח ברזולוציה גבוהה ועיבוי דיפרנציאלי בכרומוזומים אנושיים בעלי RBA. גנטיקה אנושית, 1981, 59: 187–193.
  • הכנת Rønne M. כרומוזום וטכניקות רצועה גבוהה ברזולוציה: סקירה. Journal of Dairy Science, 1989, 72: 1363–1377.

ניתן לציין בבירור כי בספרות הייחוס, כדי לקבוע כי תאים דיפלואידים המשמשים לייצור חיסונים בטוחים מבחינת היציבות הגנטית, זה מיושן. כבר לפני 40 שנה נמצאו החריגות הגנטיות הראשונות, שנחשבו זניחות לבטיחות החיסונים, וממה שדווח בהנחיות של ארגון הבריאות העולמי, מאז לא נערכו עדכונים בטכנולוגיות הרצף החדשות, בפרט ב- NGS, שהיא כלכלית יתר על כן. ומהיר, עם התוצאה שבחיסונים שניתנו במשך עשרות שנים מותרת סוכנות קיומם של DNA שעבר שינוי גנטי יותר ויותר בכמויות בלתי מבוקרות. בעניין זה ראו את הדו"ח על רצף כל הגנום MRC-5 שפורסם באתר קורבלבה בתאריך 27.09.2019. 8 בו ניכר השינוי העמוק של DNA זה גם בגנים הקשורים להתפתחות פתולוגיות של גידולים. (נתונים שמתפרסמים)

דווח על תמצית ממכתבו של ד"ר ט. דיישר, מומחה עולמי לשימוש בתאי גזע למטרות טיפוליות וטיפול גנטי, המדגיש את הדאגה מהסיכונים הנלווים לשימוש בחיסונים המזוהמים עם שאריות. של תאי העובר האנושיים: 

ד"ר ט. דיישר (מכתב לשליטים - 8 באפריל, 2019) 9 - (...) הזרקת ילדינו עם זיהום DNA עוברי אנושי טומנת בחובה את הסיכון לגרום לשתי מחלות מבוססות:

  • מוטגנזה החדרת: DNA עוברי אנושי משולב ב- DNA של התינוק הגורם למוטציות. טיפול בגנים באמצעות שילוב הומולוגי של שברים קטנים הראה שכמויות קטנות כמו 1,9 נ"ג / מ"ל ​​של מקטעי DNA גורמות להכנסה לגנום של תאי גזע ב 100% מהעכברים שהוזרקו. רמות שברי ה- DNA העוברי האנושי אצל ילדינו לאחר חיסון עם MMR, VARIVAX (אבעבועות רוח) או חיסון נגד צהבת A מגיעים לרמות העומדות על 1,9 ng / ml.
  • מחלה אוטואימונית: DNA אנושי עוברי מגרה את התגובה של מערכת החיסון לתקוף את גופו של התינוק.

התוצאות שלנו מחזקות מאוד את תצפיות הניסוי של ד"ר דיישר ומעל לכל את העובדה ש- DNA העוברי המזהם הקיים בכל הדגימות שניתחו בכמויות משתנות (ולכן לא מבוקרות) הוא עד פי 300 מהמגבלה של ה- EMA ל- DNA מסרטני (10 נ"ג / מנה, התואם ל- DNA הכלול בכ -1000 תאים סרטניים, המתקבלים על בסיס חישוב סטטיסטי, בעוד שהמגבלה המונעת זהירה היא 100 פ"ג / מנה) מגבלה שיש בהכרח להחיל גם על DNA עוברי שמזהם בהכרח את ה- Priorix טטרה.

מכאן עולה כי חיסון זה חייב להיחשב פגום ובעל פוטנציאל מסוכן לבריאות האדם, בפרט באוכלוסיית הילדים הפגיעים הרבה יותר לנזק גנטי ואוטואימוני עקב חוסר בשלות במערכות המקלט.


  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/
  2. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
  3. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate.html
    https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate-en.html
  4. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
  5. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
  6. https://www.federalregister.gov/documents/2010/03/04/2010-4553/guidance-for-industry-characterization-and-qualification-of-cell-substrates-and-other-biological
  7. https://www.who.int/biologicals/vaccines/TRS_978_Annex_3.pdf
  8. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
  9. https://www.corvelva.it/approfondimenti/notizie/mondo/lettera-aperta-ai-legislatori-sul-dna-fetale-nei-vaccini-theresa-deisher.html