Priorix Tetra menselijk genoom en MRC-5-cellijn - vergelijkende studie
Korte presentatie van de resultaten
Vandaag presenteren we een verder en zeer belangrijk diepgaand onderzoek naar de genomische sequentiebepaling van de cellijn die we vonden in het quadrivalente MPRV-vaccin (mazelen, rubella, bof en waterpokken) Priorix Tetra® en dat van de MRC-5-cellijn ( degene die naar verluidt is gebruikt bij de ontwikkeling van het vaccin zelf).
Een samenvatting van eerder gepubliceerde rapporten:
- Ten eerste hebben we aangetoond dat de hoeveelheid DNA die aanwezig is in het bovengenoemde vaccin ruim boven de toegestane drempel ligt;
- Ten tweede hebben we geverifieerd dat de cellijn eigenlijk de gedeclareerde MRC-5 is; 2
- Ten slotte hebben we de sequentiebepaling uitgevoerd van het cellijngenoom dat rechtstreeks uit het vaccin is geëxtraheerd, waarbij belangrijke mutaties werden benadrukt die openstaan voor de mogelijkheid van ernstige gezondheidsrisico's bij het gebruik van dit vaccin.
Wat we hier presenteren is precies een vergelijkend werk tussen de twee genomen: degene die we daadwerkelijk in het vaccin hebben gevonden en degene die bij de internationale cellijnbank is gekocht als MRC-5.
Het resultaat is dat de twee lijnen belangrijke verschillen vertonen vanuit het oogpunt van genetische stabiliteit. Met name het genoom van het vaccin is aanzienlijk gewijzigd in vergelijking met de cellijn die in 1966 werd geregistreerd.
Dat betekent dat de producenten, in dit geval van Priorix Tetra®, de cellijn onder optimale omstandigheden hebben gekocht vanuit het oogpunt van genetische stabiliteit en, door het continu gebruik voor productiedoeleinden, vaccins op de markt hebben gebracht die steeds meer en meer bevatten gemodificeerd menselijk genetisch materiaal, dat gevaarlijk is voor de gezondheid van de gevaccineerden zelf.
Aangezien de regelgevende instanties geen periodieke monitoring van de genetische stabiliteit van foetale lijnen vereisen en zelfs geen minimumveiligheidsdrempel vaststellen, kunnen we afleiden dat niet is voldaan aan een fundamentele vereiste voor de kwaliteit en veiligheid van vaccins die zijn verkregen uit menselijke cellijnen voor enige tijd, namelijk de noodzaak om te verifiëren dat ze geen potentieel gevaarlijke mutaties en herschikkingen ontwikkelen en om de eliminatie van de verwerking van genetische materiaalresten, indien aanwezig, te verzekeren.
Het is niet onze verantwoordelijkheid om vast te stellen welk deel van het productie- of conserveringsproces de kwaliteit en veiligheid van het product zou kunnen beïnvloeden, maar wat we vandaag kunnen bevestigen door dit rapport te publiceren, is de urgentie om onze analyseresultaten grondig te onderzoeken. we hebben de afgelopen twee jaar melding gemaakt van de focus op het eindproduct, verkocht en toegediend en niet alleen op de enkele geautoriseerde "ingrediënten".
We willen er nogmaals op wijzen dat deze producten deel uitmaken van het Italiaanse vaccinatieschema en momenteel verplicht zijn voor de pediatrische populatie in ons land, maar ook in andere Europese landen en in het algemeen over de hele wereld.
De regelgevende instanties hebben een enorme verantwoordelijkheid op het gebied van veiligheid, die momenteel onder woorden wordt gebracht, maar in de praktijk, en voor zover onze analyses aantonen, niet kan worden gegarandeerd en in feite duidelijk niet kan worden gegarandeerd.
Circulaire weergave van genomen (circusplot)
Een grafische weergave van de twee genomen genaamd 'circosplot' wordt hieronder getoond.
Toelichting bij de verschillende concentrische cirkels
- De buitenste cirkel (de eerste cirkel) is het chromosoomnummer.
- De tweede ring (blauw) vertegenwoordigt de dekking van histogramstijlaflezingen. Elk histogram is de gemiddelde dekking van een gebied van 0.5 Mbp.
- De derde ring (zwart) vertegenwoordigt de dichtheid van de INDEL's in 'dispersiegrafiek'-stijl. Elke zwarte stip wordt berekend als het aantal INDEL's (kleine invoegingen / verwijderingen) in een bereik van 1 Mbp.
- De vierde ring (groen) vertegenwoordigt de snp-dichtheid in 'dispersiegrafiek'-stijl. Elke groene stip wordt berekend als het aantal SNP's (varianten met één nucleotide) in een bereik van 1 Mbp.
- De vijfde ring vertegenwoordigt het aandeel van SNP's in homozygotie (oranje) en heterozygositeit (grijs) histogramstijl. Elk histogram wordt berekend uit een gebied van 1 Mbp.
- De zesde ring vertegenwoordigt de gevolgtrekking van CNV (Varianten in aantal exemplaren). Rood betekent winst van DNA-stukjes en groen betekent verlies.
- De meest centrale ring vertegenwoordigt de gevolgtrekking van SV (structurele varianten) in de hexagonale en splitsingsgebieden. TRA (oranje, translocaties), INS (groen, invoegingen), DEL (verwijderingen, grijs), DUP (duplicaties, roze) en INV (inversies, blauw).
Conclusie
De twee genomen vertonen belangrijke verschillen. In het bijzonder lijkt het genoom van het vaccin ernstig te zijn gemuteerd in vergelijking met de cellijn die in 1966 werd gedeponeerd. een van de originele voorraad.
Farmaceutische bedrijven die cellijnen gebruiken voor de productie van medicijnen en vaccins hebben hun eigen MRC-5-lijn, maar dit feit verandert onze twijfel niet, dat wil zeggen dat er geen periodiek verzoek is om monitoring van genetische stabiliteit, en dit is een groot probleem in onze uitzicht, vooral omdat dit is toegestaan zonder een drempellimiet.
Download link: CORVELVA-Priorix-Tetra-humaan-genoom-en-MRC-5-cel-line.pdf
Priorix Tetra® menselijk genoom en MRC-5-cellijn - vergelijkende studie (ATCC-standaard MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)
De aanwezigheid van rubella-virus werd aangetoond door het sequencen van een RNA-seq-bibliotheek met extreem hoge diepte (ongeveer 260 miljoen sequenties geproduceerd door Illumina). Er zijn 114 sequenties van 260 miljoen gedetecteerd, gelijk aan 0.00004% van de totale sequenties. De rubella-genoomsequenties zijn vervolgens handmatig bevestigd met de BLAST-software (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). De bibliotheek op lagere diepte gesequenced (ongeveer 12 miljoen matchsequenties Illumina, gelijk aan 6 miljoen fragmenten van bibliotheeksequencing) had in deze batch de aanwezigheid van ELKE reads die toe te schrijven zijn aan rubella niet gedetecteerd.
Andere virussequenties in het vaccin (waterpokken, mazelen en bof) zijn ook op dezelfde handmatige manier gevalideerd, wat bevestigt dat ze correct waren toegewezen.
Introductie
De sequencers van de nieuwe generatie zijn het gereedschap bij uitstek geworden voor gedetailleerde analyse op het gebied van biologie en geneeskunde, vooral de precisie. Deze tools maken een nieuwe en meer globale benadering mogelijk van een reeks toepassingen zoals de novo sequencing, metagenomics, epigenomics, transcriptome sequencing en genome re-sequencing.
De laatste toepassing (re-sequencing) is wijdverbreid in het menselijk veld, zowel voor onderzoek als diagnostische doeleinden, en bestaat uit de sequentiebepaling met NGS-technologie (Next Generation Sequencing) van een volledig individueel genoom om afzonderlijke nucleotidemutaties (SNP, uitspraak ') in kaart te brengen knip '), inserties en deleties van min of meer lange sequenties kwamen voor op bepaalde posities van het genoom en variaties in het aantal kopieën van delen van genoom / genen (CNV, Copy Number Variants).
De sequentiebepalingsprocedure vereist dat het DNA van een individu mechanisch wordt gebroken in kleine fragmenten (400-500 bp) en deze fragmenten zijn gekoppeld aan kanalen van kunstmatig DNA, adapters genaamd, die het mogelijk maken de fragmenten van menselijk DNA op een glasoppervlak te fixeren waarop de bases worden afgelezen (A, C, G, T).
De DNA-meting wordt verkregen door middel van het opnemen van chemische reacties van nucleotiden die zijn gelabeld met fluorescerende moleculen. De miljoenen sequenties (afgelezen) die worden verkregen door sequentiebepaling vonden plaats op het glasoppervlak, werden vervolgens met de juiste software in kaart gebracht op de menselijke genoomreferentie en vervolgens werden alle varianten die in het geanalyseerde genoom aanwezig waren vergeleken met de referentie geïdentificeerd.
Deze zelfde procedure werd uitgevoerd op het menselijke genoom dat aanwezig is in Priorix Tetra® batch n. A71CB256A en op het DNA geëxtraheerd uit de MRC-5 cellijn, geregistreerd in 1966 bij ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).
ATCC is de toonaangevende wereldwijde organisatie van hulpbronnen en normen voor biologische materialen met als missie de verwerving, authenticatie, productie, bewaring, ontwikkeling en distributie van referentiemicro-organismen, cellijnen en andere biologische standaardmaterialen. Het werd opgericht in 1925, toen een commissie van wetenschappers de noodzaak inzag van een gecentraliseerde verzameling biologische materialen die wetenschappers over de hele wereld van dienst zouden kunnen zijn.
De MRC-5-cellijn is afgeleid van normaal longweefsel van een 14 weken oude mannelijke foetus en werd in september 1966 door JP Jacobs in ATCC gedeponeerd. Deze cellen zouden vóór de veroudering 42 tot 46 populaties kunnen verdubbelen. begint. Het referentieartikel voor deze cellijn dateert van 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0
Resultaten
Zoals eerder aangetoond, het menselijk DNA dat aanwezig is in Priorix Tetra®-partij. n. A71CB256A (aangegeven in de volgende grafieken als "monster ID12051PT") is een compleet individueel genoom, dat wil zeggen dat het genoom-DNA van alle chromosomen van een mannelijk individu aanwezig is. De dekkingsgrafieken (gemiddelde diepte = gemiddelde dekking) van de 22 menselijke chromosomen en van de X- en Y-chromosomen worden hieronder weergegeven, voor het vaccin (afbeelding hierboven) en de MRC5-cellijn (afbeelding hieronder).
Hieronder staan de resultaten van de analyse van de verschillende soorten varianten.
Single nucleotide polymorphism (SNP) en korte invoegingen / verwijderingen (InDels)
De varianten van enkelvoudig individueel DNA (SNP, uitgesproken als 'knipsel') zijn polymorfismen, dat wil zeggen variaties van het genetische materiaal, gedragen door een enkel nucleotide. De 'InDels' zijn kleine inserties en deleties met een lengte van minder dan 50 bp en vormen een andere klasse van genomische varianten in het menselijk genoom.
SNP (single nucleotide polymorfisme) - ID12051PT
SNP (single nucleotide polymorfisme) - MRC-5
InDels (korte invoegingen / verwijderingen) - ID12051PT
InDels (korte invoegingen / verwijderingen) - MRC-5
CNV (kopie nummer varianten) en SV (structurele varianten)
Copy number varianten (CNV) zijn genomische varianten als gevolg van variaties in het aantal kopieën van relatief grote fragmenten (langer dan 50 bp) in individuele genomen. Er zijn twee soorten CNV: 'gain'-type (kopieën-gain) en' verlies'-type (kopieverlies).
Structurele varianten (SV) zijn genomische varianten met relatief grote afmetingen (> 50 bp) inclusief deleties, duplicaties, inserties, inverties en translocaties.
CNV (kopieervarianten)
SV (structurele varianten)
Circulaire visualisatie van genomen (circusplot)
Een grafische weergave van de twee genomen genomen (circosplot) wordt hieronder getoond.
Betekenis van de verschillende concentrische cirkels
- De buitenste cirkel (eerste cirkel) is het chromosoomnummer.
- De tweede ring (blauw) vertegenwoordigt de dekking van hystogram-achtige leesbewerkingen. Elk hystogram is de gemiddelde dekking van een gebied van 0,5 Mbp.
- De derde ring (zwart) vertegenwoordigt de dichtheid van de INDEL's in een 'dispersiegrafiekstijl'. Elk zwart punt wordt berekend als het aantal INDEL's (kleine invoegingen / verwijderingen) in een bereik van 1 Mbp.
- De vierde ring (groen) vertegenwoordigt de snp-dichtheid in een 'dispersiegrafiekstijl'. Elke groene stip wordt berekend als het aantal SNP's (single nucleotide polymorphisms) in een bereik van 1 Mbp.
- De vijfde ring vertegenwoordigt het aandeel homozygote (oranje) en heterozygote (grijze) SNP in histogramstijl. Elk histogram wordt berekend op basis van een gebied van 1 Mbp.
- De zesde ring vertegenwoordigt de CNV-conclusie (kopie-aantalvarianten). Rood betekent dat DNA-stukjes winnen en groen betekent verlies.
- De meest centrale ring vertegenwoordigt de inferentie van SV (structurele varianten) in de exonische en splicinggebieden. TRA (translocatie, oranje), INS (invoegingen, groen), DEL (verwijderingen, grijs), DUP (duplicaties, roze) en INV (inversies, blauw).
Conclusies
Deze twee genomen vertonen belangrijke verschillen. In het bijzonder blijkt het vaccingenoom sterk veranderd te zijn in vergelijking met dat van de cellijn die in 1966 is afgezet. Er werd gezegd dat we niet de mogelijkheid hadden om de sequentiebepaling uit te voeren van de cellijn die door GlaxoSmithKline wordt gebruikt voor de productie van het Priorix Tetra®-vaccin, maar dat van de originele voorraad. Farmaceutische bedrijven die cellijnen gebruiken voor de productie van medicijnen en vaccins hebben hun eigen MRC-5-lijn, maar dit verandert niets aan onze vermoedens, dat wil zeggen dat het feit dat genetische stabiliteitscontrole niet periodiek vereist is, naar onze mening zeer ernstig is, vooral omdat het toegestaan is om zonder limietdrempel aanwezig te zijn.
conclusies
De twee genomen vertonen belangrijke verschillen. In het bijzonder blijkt het vaccingenoom sterk te veranderen in vergelijking met dat van de cellijn die in 1966 is gedeponeerd. Het moet gezegd worden dat we niet de mogelijkheid hadden om de cellijn die door GlaxoSmithKline wordt gebruikt voor de productie van het Priorix Tetra-vaccin, maar die van de voorraad, te sequencen. origineel. Farmaceutische bedrijven die cellijnen gebruiken voor de productie van medicijnen en vaccins hebben hun MRC-5-lijn, maar dit verandert niets aan onze vermoedens, dat wil zeggen het feit dat genetische stabiliteitscontrole niet periodiek vereist is en dit is naar onze mening zeer ernstig vooral omdat het onbeperkt aanwezig mag zijn.