Krótka prezentacja wyników

Prezentujemy dziś kolejne bardzo ważne badanie na temat sekwencjonowania genomowego linii komórkowej znalezionego w czterowartościowej szczepionce MPRV (odra, różyczka, świnka i ospa wietrzna) Priorix Tetra, a także linii komórkowej MRC-5 (która jest deklarowana jako stosowana w rozwoju sama szczepionka).

Podsumowując poprzednie opublikowane raporty: 

1. najpierw zademonstrowaliśmy, jak ilość DNA obecna we wspomnianej szczepionce było znacznie powyżej dozwolonego;  
2. następnie zweryfikowaliśmy, że linia komórkowa jest faktycznie deklarowany MRC-5; 
3. następnie przystąpiliśmy do sekwencjonowanie genomu linii komórkowej ekstrahowanej bezpośrednio ze szczepionki, podkreślając bardzo ciężkie mutacje, które pociągają za sobą możliwość poważnego zagrożenia dla zdrowia przy stosowaniu tej szczepionki.

Prezentujemy tutaj dokładnie porównanie dwóch genomów: to, co naprawdę znaleźliśmy w szczepionce i MRC-5 zakupionym z bazy danych ATCC.

W rezultacie dwie linie przedstawiają ważne różnice z punktu widzenia stabilności genetycznej. W szczególności genom szczepionki wydaje się być silnie zmodyfikowany w porównaniu z linią komórkową zdeponowaną w 1966 r.

Oznacza to, że producenci, w tym przypadku Priorix tetra, zakupili linię komórkową w optymalnych warunkach z punktu widzenia stabilności genetycznej i przy ciągłym stosowaniu z czasem w celu produkcji wprowadzali na rynek szczepionki zawierające ludzki materiał genetyczny stopniowo coraz bardziej modyfikowany i niebezpieczny dla zdrowia zaszczepionych. 

Ponieważ agencje regulacyjne nie wymagają okresowej kontroli stabilności genetycznej linii płodowych, a nawet nie ustanawiają minimalnego progu bezpieczeństwa, możemy wywnioskować, że podstawowy wymóg dotyczący jakości i bezpieczeństwa szczepionek, które zostały uzyskanych z ludzkich linii komórkowych, to znaczy konieczności zweryfikowania, czy nie nabywają potencjalnie niebezpiecznych mutacji i rearanżacji oraz zagwarantowania eliminacji pozostałości po przetwarzaniu materiału genetycznego, jeśli są obecne.

Nie do nas należy identyfikacja, która część procesu produkcji lub konserwacji może wpłynąć na jakość i bezpieczeństwo produktu, ale to, co możemy dziś poświadczyć, publikując ten raport, to pilna potrzeba, aby organy kontrolne przeprowadziły gruntowną analizę wyników, które podkreśliły nasze analizy. w ciągu tych dwóch lat, skupiając uwagę na gotowym produkcie sprzedawanym i podawanym, a nie tylko na poszczególnych zatwierdzonych „składnikach”.

Pamiętaj jeszcze raz, że produkty te są częścią włoskiego kalendarza szczepień i są obecnie obowiązkowo podawane populacji pediatrycznej w naszym kraju, a także w innych krajach europejskich i ogólnie na całym świecie.

Organy kontrolne ponoszą ogromną odpowiedzialność za bezpieczeństwo, które obecnie jest zwiastowane słowami, ale w rzeczywistości, jak się wydaje, i jak wynika z naszych analiz, nie można zagwarantować i faktycznie jest to zlekceważone.

Kołowa wizualizacja genomów (wykres cyrkowy)

Graficzną reprezentację dwóch genomów zwanych „polem okrężnym” pokazano poniżej.

Znaczenie różnych koncentrycznych kół

1. Zewnętrzne koło (pierwsze koło) to liczba chromosomów.
2. Drugi pierścień (niebieski) reprezentuje zasięg odczytów w stylu histogramu. Każdy histogram to średni zasięg o powierzchni 0,5 Mbp.
3. Trzeci pierścień (czarny) reprezentuje gęstość INDELI w stylu „wykresu dyspersji”. Każdy czarny punkt jest obliczany jako liczba PĘTLI (Małe wstawienia / usunięcia) w zakresie 1 Mbp.
4. Czwarty pierścień (zielony) reprezentuje snp gęstości w stylu „wykresu dyspersji”. Każda zielona kropka jest obliczana jako liczba SNP (wariantów pojedynczego nukleotydu) w zakresie 1 Mbp.
5. Piąty pierścień reprezentuje proporcję homozygotyczności (pomarańczowy) i heterozygotyczności (szary) SNP w stylu histogramu. Każdy histogram jest obliczany na podstawie regionu 1 Mbp.
6. Szósty pierścień reprezentuje wnioskowanie CNV (warianty w liczbie kopii). Czerwony oznacza zdobycie kawałków DNA, a zielony oznacza utratę.
7. Najbardziej centralny pierścień reprezentuje wnioskowanie SV (warianty strukturalne) w obszarach egzonicznych i splicingowych. MIĘDZY (pomarańczowy, translokacje), INS (zielony, wstawki), DEL (skreślenia, szary), DUP (duplikacje, różowy) i INV (inwersje, niebieski).

wnioski

Dwa genomy wykazują ważne różnice. W szczególności genom szczepionki okazał się silnie zmieniony w porównaniu z linią komórkową zdeponowaną w 1966 r. Trzeba powiedzieć, że nie mieliśmy możliwości sekwencjonowania linii komórkowej wykorzystywanej przez GlaxoSmithKline do produkcji szczepionki Priorix Tetra, ale zapasów oryginalne. Firmy farmaceutyczne, które wykorzystują linie komórkowe do produkcji leków i szczepionek, mają swoją linię MRC-5, ale to nie zmienia naszych podejrzeń, to jest fakt, że kontrola stabilności genetycznej nie jest wymagana okresowo i jest to naszym zdaniem bardzo poważne , przede wszystkim dlatego, że może być obecny bez ograniczeń.

Download: CORVELVA-porównanie ludzkim genom-Priorix-Tetra-a-line-MRC-5.pdf

Porównanie ludzkiego genomu zawartego w Priorix Tetra i linii komórkowej MRC-5 (standard ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

Obecność wirusa różyczki wykazano przez sekwencjonowanie wyjątkowo głębokiej biblioteki sekwencji RNA (wyprodukowano około 260 milionów sekwencji Illumina). Wykryto 114 z 260 milionów sekwencji, co stanowi 0.00004% całkowitej sekwencji. Sekwencje genomu różyczki potwierdzono następnie ręcznie za pomocą oprogramowania BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Zsekwencjonowana biblioteka na niższej głębokości (około 12 milionów sparowanych sekwencji Illumina, równa 6 milionom zsekwencjonowanych fragmentów biblioteki) nie wykryła ŻADNEGO odczytu, który można przypisać różyczce w tej partii.

Sekwencje innych wirusów obecnych w szczepionce (ospa wietrzna, odra i świnka) również zostały sprawdzone w ten sam ręczny sposób, potwierdzając, że zostały poprawnie przypisane.

wprowadzenie

Sekwencery nowej generacji stały się instrumentem z wyboru do dogłębnych analiz w dziedzinie biologii i medycyny, zwłaszcza precyzyjnej. Narzędzia te umożliwiają nowe i bardziej globalne podejście do szeregu zastosowań, takich jak sekwencjonowanie de novo, metagenomika, epigenomika, sekwencjonowanie transkryptomów i ponowne sekwencjonowanie genomu.

Ta ostatnia aplikacja (ponowne sekwencjonowanie) jest bardzo rozpowszechniona w dziedzinie ludzkiej zarówno do celów badawczych, jak i diagnostycznych i polega na sekwencjonowaniu technologii NGS (Next Generation Sequencing) całego pojedynczego genomu w celu zmapowania pojedynczych mutacji nukleotydowych (SNP, snip wymowy ”), wstawienia i usunięcia dłuższych lub krótszych sekwencji nastąpiły w niektórych pozycjach genomu i zmiany liczby kopii części genomu / genów (CNV, warianty liczby kopii).

Procedura sekwencjonowania wymaga, aby DNA osobnika zostało mechanicznie rozbite na małe fragmenty (400-500 par zasad), a fragmenty sztucznych dróg DNA zwanych adapterami są przywiązane do fragmentów, które pozwalają na wiązanie fragmentów ludzkiego DNA z szklana powierzchnia, na której następnie odczytywane są podstawy (A, C, G, T). Zasady DNA odczytywane są poprzez włączenie reakcji chemicznych nukleotydów znakowanych cząsteczkami fluorescencyjnymi. Miliony sekwencji (odczytów) uzyskane z sekwencjonowania na szklanej powierzchni są następnie mapowane na ludzkim genomie referencyjnym za pomocą odpowiedniego oprogramowania, a następnie identyfikowane są wszystkie warianty obecne w analizowanym genomie w porównaniu do referencji.

Tę samą procedurę przeprowadzono na ludzkim genomie obecnym w partii Priorix Tetra. N. A71CB256A i na DNA ekstrahowanym z linii komórkowej MRC-5, zdeponowanej w 1966 r. W ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC jest wiodącą na świecie organizacją zasobów i standardów materiałów biologicznych, której misja koncentruje się na pozyskiwaniu, uwierzytelnianiu, produkcji, przechowywaniu, rozwoju i dystrybucji mikroorganizmów odniesienia, linii komórkowych i innych standardowych materiałów biologicznych. Zostało założone w 1925 r., Kiedy komitet naukowców uznał potrzebę scentralizowanego zbioru materiałów biologicznych, który mógłby służyć naukowcom z całego świata.

Linia komórkowa MRC-5 pochodzi z prawidłowej tkanki płucnej 14-tygodniowego płodu męskiego i została zdeponowana w ATCC przez JP Jacobs we wrześniu 1966 r. Mówi się, że komórki te mogą podwoić 42 do 46 populacji przed inicjacją. starzenia się. Artykuł referencyjny dla tej linii komórkowej pochodzi z 1970 roku: https://www.nature.com/articles/227168a0

wyniki

Jak wcześniej pokazano, ludzkie DNA obecne w partii Priorix Tetra. N. A71CB256A (wskazany na poniższych wykresach jako próbka ID12051PT) jest kompletnym indywidualnym genomem, tzn. Istnieje genomowy DNA wszystkich chromosomów osobnika męskiego. Wykresy pokrycia (średnia głębokość = średnie pokrycie) 22 ludzkich chromosomów oraz chromosomów X i Y pokazano poniżej, dla szczepionki (zdjęcie powyżej) i linii komórkowej MRC5 (zdjęcie poniżej).

Wyniki analizy różnych rodzajów wariantów pokazano poniżej.

Warianty pojedynczego nukleotydu (SNP) i krótkie insercje / delecje (InDels)

Warianty pojedynczych zasad DNA (SNP, wymawiane „wycinanie”) są polimorfizmami, to znaczy odmianami materiału genetycznego przenoszonego przez pojedynczy nukleotyd. „InDels” to małe insercje i delecje o długości mniejszej niż 50 pz i stanowią kolejną klasę wariantów genomowych w ludzkim genomie.

SNP (warianty z pojedynczym nukleotydem) - ID12051PT

SNP (warianty pojedynczego nukleotydu) - MRC-5

WSKAŹNIKI (małe wstawienia / usunięcia) - ID12051PT

WSKAŹNIKI (małe wstawienia / usunięcia) - MRC-5 

CNV (warianty numerów kopii) i SV (warianty strukturalne)

Warianty liczby kopii (CNV) są wariantami genomowymi z powodu zmian liczby kopii stosunkowo dużych fragmentów (dłuższych niż 50 pz) między poszczególnymi genomami. Istnieją dwa rodzaje CNV: typ „wzmocnienia” (wzmocnienie kopii) i „utrata” (utrata kopii).

Warianty strukturalne (SV) to warianty genomowe o stosunkowo dużych rozmiarach (> 50 pz), w tym delecje, duplikacje, insercje, inwersje i translokacje.

CNV (różnice w liczbie kopii)

SV (warianty konstrukcyjne)

Kołowa wizualizacja genomów (wykres cyrkowy)

Graficzną reprezentację dwóch genomów zwanych „polem okrężnym” pokazano poniżej.

Znaczenie różnych koncentrycznych kół

1. Zewnętrzne koło (pierwsze koło) to liczba chromosomów.
2. Drugi pierścień (niebieski) reprezentuje zasięg odczytów w stylu histogramu. Każdy histogram to średni zasięg o powierzchni 0,5 Mbp.
3. Trzeci pierścień (czarny) reprezentuje gęstość INDELI w stylu „wykresu dyspersji”. Każdy czarny punkt jest obliczany jako liczba PĘTLI (Małe wstawienia / usunięcia) w zakresie 1 Mbp.
4. Czwarty pierścień (zielony) reprezentuje snp gęstości w stylu „wykresu dyspersji”. Każda zielona kropka jest obliczana jako liczba SNP (wariantów pojedynczego nukleotydu) w zakresie 1 Mbp.
5. Piąty pierścień reprezentuje proporcję homozygotyczności (pomarańczowy) i heterozygotyczności (szary) SNP w stylu histogramu. Każdy histogram jest obliczany na podstawie regionu 1 Mbp.
6. Szósty pierścień reprezentuje wnioskowanie CNV (warianty w liczbie kopii). Czerwony oznacza zdobycie kawałków DNA, a zielony oznacza utratę.
7. Najbardziej centralny pierścień reprezentuje wnioskowanie SV (warianty strukturalne) w obszarach egzonicznych i splicingowych. MIĘDZY (pomarańczowy, translokacje), INS (zielony, wstawki), DEL (skreślenia, szary), DUP (duplikacje, różowy) i INV (inwersje, niebieski).

wnioski

Dwa genomy wykazują ważne różnice. W szczególności genom szczepionki okazał się silnie zmieniony w porównaniu z linią komórkową zdeponowaną w 1966 r. Trzeba powiedzieć, że nie mieliśmy możliwości sekwencjonowania linii komórkowej wykorzystywanej przez GlaxoSmithKline do produkcji szczepionki Priorix Tetra, ale zapasów oryginalne. Firmy farmaceutyczne, które wykorzystują linie komórkowe do produkcji leków i szczepionek, mają swoją linię MRC-5, ale to nie zmienia naszych podejrzeń, to jest fakt, że kontrola stabilności genetycznej nie jest wymagana okresowo i jest to naszym zdaniem bardzo poważne , przede wszystkim dlatego, że może być obecny bez ograniczeń.