Pierwsza publikacja recenzująca na temat szczepionek MPRV (Priorix Tetra)

Kostur Corvelva Szczepionka 31 marca 2020

W końcu jesteśmy na miejscu, po prawie dwóch latach ukazuje się pierwsza publikacja w recenzjach naszych analiz i wiele innych.

Tutaj staramy się streścić na tych pierwszych stronach w bardzo dyskursywny i nietechniczny sposób: co zostało opublikowane, jaką ma ważność i dlaczego jest ważne dla naszego badania szczepionek.

(Z drugiej strony strony od 3 do XNUMX poświęcone są analizie technicznej, pozostawiając ocenę samego artykułu osobom pracującym w sektorze)

Co opublikowano w „F1000 Research” ¹ jest to wynik początkowej części prac przeprowadzonych w imieniu Stowarzyszenia Corvelva przez jedno z laboratoriów odpowiedzialnych za analizy. Przypomnijmy - ponieważ od rozpoczęcia tej pracy minęły ponad dwa lata, a do początkowych dodano wiele innych wyników - że pierwszym poważnym problemem, który musieliśmy zbadać, była nienormalna ilość ludzkiego DNA znaleziona w analizowanych szczepionkach.

W obu analizowanych czterowartościowych szczepionkach MPRV początkowo znaleziono ilości od 1 do 2,7 mikrograma / fiolkę (zgodnie z daną publikacją), co doprowadziło nas do publicznego i natychmiastowego zgłoszenia tego wyniku, ponieważ po prostu nie oczekiwano, że ta ilość DNA była obecna w szczepionce.

Oprócz rozważań i wniosków, do których dochodzi praca, które są ściśle techniczne, a zatem zrozumiałe tylko dla tych, którzy prowadzą badania w dziedzinie metagenomiki, na wykresach widać, że dwie próbki szczepionki zawierają wysoki procent odczyty ludzkiego DNA oprócz tych oczekiwanych na podstawie genomu wirusa ospy wietrznej (ludzki wirus alfaaherpes 3), wykrywalny tylko z czterech, w artykule przedstawiono analizę sekwencji DNA.
Chcielibyśmy jednak podkreślić, że później ilości DNA znalezione i potwierdzone tym samym sprawdzona tutaj metoda były jeszcze wyższe: do 3,7 mikrograma na fiolkę, co prowadzi do znacznej różnicy między partiami i partiami.
W rzeczywistości w naszym raporcie opublikowanym 22.12.2018 ² wyniki zostały zgłoszone dla dalsze części przeanalizowane po omówionych w artykule, a następnie potwierdzone przez analizy międzylaboratoryjne, które są nadal publikowane.

Dlatego najbardziej interesuje nas ta publikacja, która potwierdza walidację zastosowanej metody, kładzie duży nacisk na dyskusje na temat „rodzaju” przeprowadzonych analiz, aw konsekwencji zdecydowanie potwierdza wszystkie prace wykonane później metodą NGS: wgląd w rodzaj zawartego materiału genetycznego, obecność wirusów przypadkowych, wielki brak atenuowanych wirusów, które powinny być obecne i ilość zamiast kontroli (również dlatego, że bardzo różni się od próbki do próbki) obecnego ludzkiego DNA, zmutowana populacja , fagi, DNA innych gatunków i stopniowo wszystkie wyniki, które znajdziesz podsumowane na naszej stronie. ³

Wszystko, co z punktu widzenia zawartości biologicznej potępialiśmy w ostatnich latach, niewolniczo zgłaszając wyniki organom kontrolnym, nabiera bardziej adekwatnego konotacji naukowej (nawet jeśli, powtarzamy to ponownie, to nie recenzje wzajemne musiały się martwić ale przedstawione dane, bardzo poważne pod względem treści i możliwych konsekwencji dla zdrowia ludzkiego). Jednak teraz, gdy opublikowano metodę, będziemy żądać odpowiedzi, które jeszcze nie dotarły.

Wyniki te jednoznacznie potwierdzają obecność DNA płodu w szczepionkach Priorix tetra, w ilościach różniących się między poszczególnymi partiami, co wskazuje na słabą kontrolę jakości tych produktów farmaceutycznych.

Przypominamy również raport z sekwencjonowania całego genomu MRC-5 opublikowany na stronie internetowej Corvelva w dniu 27.09.2019 ⁴ w których głęboka modyfikacja tego DNA jest widoczna także w genach związanych z rozwojem patologii nowotworów (inne dane są publikowane).

Zanieczyszczający płodowy DNA obecny we wszystkich próbkach analizowanych w zmiennych ilościach (dlatego niekontrolowanych) jest do 300 razy wyższy niż limit ustalony przez EMA dla rakotwórczego DNA (10 ng / dawkę, odpowiadający DNA zawartemu w około 1000 komórek rakowych, uzyskany na podstawie obliczeń statystycznych, podczas gdy limit ostrożnościowy wynosi 100 pg / dawkę) limit, który należy koniecznie zastosować również do DNA płodu, który nieuchronnie zanieczyszcza Priorix Tetra.

Wynika z tego, że szczepionkę tę należy uznać za wadliwą i potencjalnie niebezpieczną dla zdrowia ludzkiego, w szczególności populacji pediatrycznej o wiele bardziej podatnej na uszkodzenia genetyczne i autoimmunologiczne z powodu niedojrzałości w systemach schronienia.

Zgodnie z przewidywaniami poniższe elementy są bardziej „techniczne” i trudne do zrozumienia dla osób niebędących specjalistami, dlatego postanowiliśmy, również w celu zachowania przejrzystości, dołączyć do tego dokumentu również „Dokumentacja EMA - NGS Omówienie wyników uzyskanych z badania jakości szczepionki”, Musieliśmy jedynie ekstrapolować ujawnioną część, ponad 50 stron dokumentacji w porównaniu do 200 NGS, ponieważ większość informacji zawartych i zarejestrowanych w organach regulacyjnych musi pozostać poufna. Surowe prawo nauki wymaga, aby dane były publikowane w czasopiśmie tylko w przypadku niepublikowania, a my, mając kilka innych publikacji w toku, nie chcemy narażać ich na ryzyko.

Wreszcie, aby uniknąć nieporozumień, chcemy wspomnieć z publikacji część „Deklaracji finansowania”:

„Sekwencjonowanie metagenomiczne B1 i B2 zostało sfinansowane przez Corvelva (stowarzyszenie non-profit, Veneto, Włochy) w ramach umowy serwisowej z laboratorium. Żadne inne wkłady nie były zaangażowane we wspieranie pracy. Darczyńcy nie odegrali żadnej roli w projekcie badania, w gromadzeniu i analizie danych, w decyzji o publikacji lub w przygotowaniu manuskryptu ”.

Załączniki:

W artykule „Czy mnie kochasz? Wpływ zmniejszenia zasięgu na badania sekwencjonowania strzelby metagenomowej ”

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

Autorzy zajmują się techniczno-metodologicznym pytaniem, czy możliwe jest zastosowanie masowego podejścia metagenomiki równoległej z niskim zakresem odczytu do scharakteryzowania złożonych matryc biologicznych. Szacunki dotyczące różnorodności i liczebności gatunków są obliczane, a zdolność do rekonstrukcji metagenomu de novo pod względem długości i kompletności jest oceniana w celu zrozumienia, jak bardzo spadek głębokości sekwencjonowania, zmieniony przez losowe podpróbkowanie odczytów sekwencjonowania, może Wyniki pokazują, że wskaźniki różnorodności zbiorowisk prokariotycznych, eukariotycznych i wirusowych można dokładnie oszacować na podstawie 500.000 1.000.000 odczytów lub mniej, chociaż szczególnie złożone próbki mogą wymagać 1.000.000 XNUMX XNUMX odczytów. Z drugiej strony projekt polegający na rekonstrukcji metagenomu i zawartych w nim genów wymaga liczby większej niż XNUMX XNUMX XNUMX odczytów.

Wśród różnych i bardzo różnych złożonych matryc poddanych masowej analizie metagenomicznej, uwzględniono dwa leki biologiczne, czyli dwie różne partie żywej atenuowanej szczepionki MPRV stosowanej do immunizacji przeciwko odrze, śwince, różyczce i ospie wietrznej u dzieci. DNA zostało wyodrębnione ze szczepionek, następnie biblioteki genomowe zbudowano przy użyciu standardowych komercyjnych protokołów i przeprowadzono masowe sekwencjonowanie w technologii Illumina.

Oprócz rozważań i wniosków, do których dochodzi praca, które są ściśle techniczne, a zatem zrozumiałe tylko dla osób prowadzących badania w dziedzinie metagenomiki, to, co zaobserwowano na wykresach kołowych zawartych w „danych rozszerzonych” (https://osf.io/wq395/ próbki B1 i B2) to stwierdzenie, że dwie próbki szczepionki zawierają wysoki procent odczytów ludzkiego DNA oprócz tych, których oczekuje się od genomu wirusa ospy wietrznej (ludzki wirus alfaherpes 3), jedyny wykrywalny spośród czterech, znajdujący się w artykule przedstawiono analizę typu DNA-seq.

71% odczytów w jednej partii i 88% w drugiej jest pochodzenia ludzkiego, przypuszczalnie pochodząc z linii komórkowej pochodzenia płodowego MRC-5 (pamiętaj, że kolejne analizy potwierdziły, że linia to MRC5), w którym podczas przygotowywania szczepionki hodowane są żywe atenuowane wirusy różyczki i ospy wietrznej. Ponadto, jak to miało miejsce w różnych partiach tej samej szczepionki MPRV badanej przez Corvelva w latach 2017-2019, ilość ekstrahowanego DNA jest rzędu mikrograma.

W partiach szczepionek testowanych przy użyciu tych samych protokołów i technologii opisanych w materiałach i metodach wyrobu wykryte ilości wahały się od 1 do prawie 3 mikrogramów na fiolkę, ilości wahały się między partiami, ale zawsze były znaczące

Corvelva mprv1

B1 https://osf.io/86mbn/

Corvelva mprv1

B2 https://osf.io/dxayz/

W raporcie ujawnionym przez Corvelva w dniu 22.12.2018 zgłoszono następujące wyniki dalsze części przeanalizowane po omówionych w artykule, a następnie potwierdzone przez wciąż publikowane analizy międzylaboratoryjne:

Priorix Tetra lot. A71CB205A (czerwiec 2018 r.) - Analiza DNA

Corvelva mprv3

Priorix Tetra lot. A71CB256A (grudzień 2018 r.) - Analiza DNA

Corvelva mprv3

Analiza DNA

Pomiar stężenia DNA z fluorymetrem QuBit pokazał, że partia A71CB205A zawiera pewną ilość 1.7 ug gDNA sumy na dawkę 0.5 ml, obliczone w następujący sposób: 9.41 ng / µl (stężenie określone w QuBit) x 45 (końcowa objętość DNA zawiesiny po ekstrakcji, wyrażona w mikrolitrach) x 4 (objętość początkowa poddana procedurze ekstrakcji wynosi ¼ objętość dawki zawartej w całej fiolce równa 0.5 ml).

Pomiar stężenia DNA z fluorymetrem QuBit pokazał, że partia A71CB256A zawiera pewną ilość gDNA o łącznej wartości 3.7 µg na dawkę 0.5 ml, obliczone w następujący sposób: 40.8 ng / µl (stężenie określone w QuBit) x 55 (końcowa objętość DNA w zawiesinie po ekstrakcji wyrażona w mikrolitrach) x 5/3 (objętość początkowa poddana procedurze ekstrakcji wynosi 300 µl z 500 µl zawiesiny).

Ludzki DNA znaleziony w tej partii ma względny stosunek około 8 do 1 w porównaniu z DNA ospy wietrznej (patrz następujące wyniki klasyfikacji fragmentów sekwencji DNA, w których okazuje się, że 88% wszystkich zsekwencjonowanych fragmentów DNA stanowi pochodzenia ludzkiego, a 11% pochodzi z genomu wirusa ospy wietrznej). Biorąc pod uwagę, że NGS jest technologią ilościową, fluorymetryczna kwantyfikacja całkowitego DNA ekstrahowanego ze szczepionki (np. Partia. A71CB256A = 3,7 mikrograma na dawkę), związana z rozważeniem względnej kwantyfikacji dokonanej powyżej (8: 1), pozwala nam powiedzieć, że ludzkie DNA może być w pobliżu 2,9 mikrograma na dawkę, w porównaniu do około 740 nanogramów DNA ospy wietrznej. Jest również prawdopodobne, że co najmniej część DNA o wysokiej masie cząsteczkowej widoczna na żelu może być ludzkim DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.

Analiza RNA

Ilość RNA Stwierdzono, że zawartość fiolki zawierającej partię szczepionki A71CB256A była w przybliżeniu 200ng.

RIN równy 8 wskazuje na doskonałej jakości RNA i nienaruszony eukariotyczny RNA, ponieważ obecne są zarówno piki 18S, jak i 28S typowe dla eukariotycznego RNA.

Odpowiedzi na nasze pytania przekazywane z biegiem czasu organom regulacyjnym mają ogromne znaczenie. Obecnie agencje nie odpowiedziały jeszcze na pytania dotyczące wyników pełnych analiz przekazanych EMA i AIFA.

Fragment odpowiedzi EMA na nasze pytanie dotyczące bezpieczeństwa pozostałości mrc-5 w szczepionce Priorix Tetra (numer referencyjny wniosku EMA ask-43967 3 sierpnia 2018) - „Na podstawie opublikowanych informacji Priorix Tetra zawiera szczepy wirusowe wytwarzane osobno w komórkach zarodka kurzego (świnka i odra) lub w ludzkich komórkach diploidalnych MRC-5 (różyczka i ospa wietrzna). Linie komórkowe zastosowane w Priorix Tetra obejmują ludzkie diploidalne linie komórkowe, które nie mogą się ciągle dzielić. Należy zauważyć, że zgodnie z Farmakopeą Europejską diploidalne linie komórkowe MRC-5 nie są rakotwórcze, co potwierdzają dziesięciolecia użytkowania i kontroli, a zatem nie ma zastosowania maksymalny limit DNA komórek MRC-5 ”

Do chwili obecnej nie dostarczono żadnych dowodów (ani w postaci certyfikatów analizy jakości produktu, ani literatury naukowej dla EMA) na te kontrole, które gwarantują, że nie należy stosować maksymalnego limitu.

W wytycznych FDA „Wytyczne dla przemysłu: charakterystyka i kwalifikacja substratów komórkowych i innych materiałów biologicznych stosowanych w produkcji szczepionek wirusowych do wskazań chorób zakaźnych” ⁶ donosi się, że:

szczep komórek diploidalnych powinien zawsze pozostać diploidalny. Jeżeli te cechy nie są stabilne, konieczne jest wykazanie, że niestabilność nie wpływa negatywnie na produkcję lub zgodność produktu.
w przypadku szeroko stosowanych szczepów ludzkich komórek diploidalnych, takich jak komórki MRC-5 i WI-38, pomiar resztkowego DNA może nie być konieczny, ponieważ nie uważamy resztkowego DNA tych ludzkich diploidalnych komórek za zagrożenie dla bezpieczeństwa
resztkowy DNA powinien być ograniczony dla nienowotworowych ciągłych komórek, takich jak dolnoprzepustowe komórki VERO, mniej niż 10 ng / dawkę do zaszczepienia pozajelitowego zgodnie z zaleceniami WHO

I w wytycznych WHO „Załącznik 3 - Zalecenia dotyczące oceny kultur komórek zwierzęcych jako substratów do produkcji leków biologicznych i charakteryzacji banków komórek. Zastąpienie załącznika 1 do serii raportów technicznych WHO, n. 878 " ⁷ dodajemy: (...) od lat sześćdziesiątych zgromadzono znaczne doświadczenie w cytogenetyce WI-38 i MRC-5

Aby wesprzeć to doświadczenie, wymieniono następujące artykuły:

Jacobs JP. Zaktualizowano wyniki kariologii szczepów komórkowych WI-38, MRC-5 i MRC-9. Developments in Biological Standization, 1976, 37: 155–156.
Jacobs JP. i in. Wytyczne dotyczące dopuszczalności, zarządzania i testowania seryjnie namnażanych ludzkich komórek diploidalnych do produkcji żywych szczepionek wirusowych do stosowania u ludzi. Journal of Biological Standization, 1981, 9: 331–342.
Petricciani JC i in. Standardy kariologiczne dla diploidalnej linii komórkowej rezus DBS-FRhL-2. Journal of Biological Standization, 1976, 4: 43–49.
Schollmayer i in. Analiza wysokiej rozdzielczości i różnicowa kondensacja w ludzkich chromosomach z pasmem RBA. Human Genetics, 1981, 59: 187–193.
Rønne M. Przygotowanie preparatów chromosomowych i techniki pasmowania w wysokiej rozdzielczości: przegląd. Journal of Dairy Science, 1989, 72: 1363–1377.

Można wyraźnie zauważyć, że literatura referencyjna, aby utrzymać komórki diploidalne stosowane do produkcji szczepionek, jest bezpieczna z punktu widzenia stabilności genetycznej, jest przestarzały, Już 40 lat temu odkryto pierwsze anomalie genetyczne, uważane za nieistotne dla bezpieczeństwa szczepionek i na podstawie tego, co podano w wytycznych WHO, od tego czasu nie wprowadzono żadnych aktualizacji nowych technologii sekwencjonowania, w szczególności w NGS, co jest ponadto ekonomiczne i szybki, w konsekwencji w podawanych szczepionkach od dziesięcioleci agencje zezwalają na obecność coraz bardziej stopniowo modyfikowanego genetycznie DNA w niekontrolowanych ilościach. W tym względzie zobacz raport na temat sekwencjonowania całego genomu MRC-5 opublikowany na stronie internetowej Corvelva w dniu 27.09.2019. ⁸ w których głęboka modyfikacja tego DNA jest widoczna również w genach związanych z rozwojem patologii nowotworowych. (dane są publikowane)

Przedstawiono wyciąg z listu dr T. Deishera, światowego eksperta w dziedzinie wykorzystania komórek macierzystych do celów terapeutycznych i terapii genowej, który podkreśla obawy związane z ryzykiem związanym ze stosowaniem szczepionek zanieczyszczonych pozostałościami ludzkich komórek płodowych:

Dr T. DEISHER (list do władców - 8 kwietnia 2019 r.) ⁹ - (...) wstrzyknięcie naszym dzieciom skażenia DNA płodu ludzkiego niesie ryzyko wywołania dwóch dobrze znanych chorób:

mutageneza insercyjna: ludzkie DNA płodu jest włączone do DNA dziecka powodującego mutacje. Terapia genowa z zastosowaniem homologicznej rekombinacji małych fragmentów wykazała, że ilości tak małe jak 1,9 ng / ml fragmentów DNA powodują wstawienie do genomu komórek macierzystych u 100% wstrzykniętych myszy. Poziomy fragmentów DNA ludzkiego płodu u naszych dzieci po szczepieniu szczepionkami MMR, VARIVAX (ospa wietrzna) lub wirusowym zapaleniem wątroby typu A osiągają poziomy powyżej 1,9 ng / ml.
choroba autoimmunologiczna: ludzki DNA płodu stymuluje reakcję układu odpornościowego do ataku na ciało dziecka.

Uzyskane przez nas wyniki znacznie wzmacniają obserwacje doświadczalne dr Deishera, a przede wszystkim fakt, że zanieczyszczające DNA płodu obecne we wszystkich analizowanych próbkach w zmiennych (a więc niekontrolowanych) ilościach do 300 razy więcej niż limit EMA dla rakotwórczego DNA (10 ng / dawkę, odpowiadającą DNA zawartemu w około 1000 komórek rakowych, uzyskanym na podstawie obliczeń statystycznych, podczas gdy limit ostrożności wynosi 100 pg / dawkę) limit, który musi być koniecznie stosowany również do DNA płodu, który nieuchronnie zanieczyszcza Priorix Tetra.

CZEGO SZUKASZ?

Popularne tagi

Szczepionka

Pierwsza publikacja recenzująca na temat szczepionek MPRV (Priorix Tetra)

Załączniki:

W artykule „Czy mnie kochasz? Wpływ zmniejszenia zasięgu na badania sekwencjonowania strzelby metagenomowej ”

Priorix Tetra lot. A71CB205A (czerwiec 2018 r.) - Analiza DNA

Priorix Tetra lot. A71CB256A (grudzień 2018 r.) - Analiza DNA

Analiza DNA

Analiza RNA

Menu główne

Najnowsze artykuły

Raport dotyczący szczepionek 2021 – Nadzór po wprowadzeniu do obrotu we Włoszech

Żółwie na drodze: nauka i mity o szczepieniach

Sto lat temu: ligi antyszczepionkowe

Śledź nas na

Papiery Corvelva