Аномальные уровни антител против кори, эпидемического паротита, краснухи и аутоиммунных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) у детей с аутизмом
Журнал биометрических наук
Сингх В.К., Лин С.Х., Ньюэлл Э, Нельсон С.
2002
Абстрактные
Аутоиммунные заболевания центральной нервной системы (ЦНС), особенно против основной миелиновый белок (MBP), может иметь причинную роль в аутизме, неврологическом расстройстве развития. Поскольку многие аутичные дети имеют высокий уровень антител против кори, мы провели серологическое исследование аутоантител против кори, эпидемического паротита, краснухи и центральной нервной системы. Используя образцы сыворотки от 125 детей с аутизмом и 92 контрольных образца, антитела анализировали с помощью теста ELISA1 и анализа иммуноблоттинга (иммунофиксация) 2. Тесты ELISA продемонстрировали значительное повышение уровня антител к MPR у детей с аутизмом. Анализ иммунофиксации выявил наличие необычного MPR-антитела в 75 из 125 сывороток от детей с аутизмом (60%) и ни одного в контрольной группе. Это антитело было специфичным в отношении белка MPR 73-75 кДа. Этот белок, анализировали с помощью моноклональных антител, белок Н был immunopositiva против кори, называемой emoagglutinina3, но не против нуклеопротеида кори и вирусных белков против краснухи и эпидемического паротита. Следовательно, антитело MPR в аутистической детской сыворотке идентифицирует H-белок кори, который специфичен для субъединицы вакцины. Кроме того, более 90% сывороток от детей с аутизмом, положительных на антитела против MPR, также были положительными на аутоантитела против основного белка миелина (MBP), что указывает на сильную связь между MPR и аутоиммунными заболеваниями центральной нервной системы при аутизме. Это свидетельствует о том, что неправильный ответ на вакцину MPR, особенно в отношении кори, может быть связан с патогенезом аутизма.
Введение
Аутизм является нарушение развития центральной нервной системы раннего начала, чья этиология и патогенез неизвестны. Расстройство вызывает серьезные нарушения высших психических функций, таких как социальное взаимодействие, язык, общение, воображение и когнитивные способности. Хотя аутизм поражает более полумиллиона американцев и даже больше во всем мире, мало что известно об этиологии и патогенезе расстройства. Современные теории включают генетические, иммунологические, неврологические и окружающую среду, а также другие неустановленные факторы. Начиная с дефектной иммунной регуляции в детей, страдающих аутизмом [10, 12, 16, 21, 23 [, внимание уделяется аутоиммунного механизма патогенеза аутизма [14-17, 19, 20]. Поскольку аутоиммунные заболевания, как правило, подозреваются в том, что они вызваны вирусами, в последнее время были проведены серологические исследования для выявления вирусов при аутизме [15, 17]. Оказалось, что многие дети, страдающие аутизмом, имели высокие уровни антител против вируса кори (MV), но не против «типа-6 человека герпесвирусов (HHV-6), цитомегаловирус или вирус краснухи (RV) , Кроме того, высокий уровень антител против кори был тесно связан с наличием аутоантител в мозге, что привело нас к постулату патогенетической ассоциации между вирусом кори и аутоиммунитетом, присутствующим при аутизме [15, 17]. Чтобы более детально определить происхождение этой инфекции кори, мы исследовали возможность чрезмерного или неадекватного ответа антител на вакцину MPR в отношении аутоиммунных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС). Как описано здесь, некоторые дети с аутизмом имеют необычные уровни антител MPR и показывают временную связь с аутоантителами против основного белка миелина (MBP), который использовался в качестве маркера аутоиммунитета ЦНС при аутизме.
Методы и материалы
Мы провели лабораторное исследование антител к MPR и аутоантител к MBP в сыворотке от детей с аутизмом и из контрольной группы. Поскольку это исследование было продолжением нашего продолжающегося исследования, мы использовали образцы сыворотки, предварительно собранные и криоконсервированные при температуре -20 ° C [14-17]. В исследовании принимали участие около 217 детей: 125 детей, страдающих аутизмом (в возрасте от 4 до 10 лет) и 92 в контрольной группе (из которых 58 нормальных детей в возрасте от 5 до 13 лет, 6 братьев или сестер нормальных возрасте от 6 до 9 лет и 28 детей в возрасте от 4 до 12 лет, у которых были другие поведенческие расстройства, не входящие в аутистический спектр). Результаты иммунологического анализа показали, что всем детям была сделана прививка против MPR, но ни у кого не было случаев кожной сыпи или дикой вирусной инфекции. Клинический диагноз аутизма был поставлен по существу в соответствии со стандартами DSM-IIIR, установленными Американской ассоциацией психиатров, Вашингтон, округ Колумбия, США, как описано ранее [14–17]. В исследовании участвовали только дети с установленным диагнозом аутизм. Комитет по этике рассмотрел и одобрил наш исследовательский протокол, предусмотренный для использования только образцов сыворотки человека. Во время сбора образцов крови или, по крайней мере, двух недель до отбора проб, ни один из пациентов, страдающих аутизмом или в контрольной группе не было принимать лекарства, такие как антипсихотических или нейролептиками. МНР антитела были первоначально найдены по иммуно-абсорбента анализа, связанного с ферментом (ELISA) для титрования сыворотки, но впоследствии были найдены по иммунофиксации анализа, чтобы сделать сыворотки скрининга. В обоих методах анализа в качестве антигена была использована вакцина MPR-II (Merck, West Point, Пенсильвания, США). Аутоантитела против основного белка миелина (ОБМ) (Upstate Biotechnology, Лейк-Плэсид, штат Нью-Йорк, США) были найдены путем анализа иммунофиксацией как рутина в нашей лаборатории. Все иммунологические тесты проводились на месте (в лаборатории) по причинам, связанным просто с конкретной природой исследования и потому, что в настоящее время они не доступны из какого-либо коммерчески доступного источника.
Поиск MPR-антител с помощью ELISA-теста проводился на основании ранее проведенных нами исследований с использованием этого метода [18]. Вкратце, микролунки микротитровального планшета Costar (Corning, Corning, NY, USA) были покрыты антигеном MPR, растворенным в фосфатном буферном солевом растворе.4 по тел 7,4. Планшет трижды промывали 0,05% PBF-твин буфером. 100 мкл / лунку солевого фосфатного буфера пипетировали в белые микро лунки5 или человеческая сыворотка, предварительно разведенная в четырех разведениях в тестовых микролунках. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. После трех промывок буфером PBF-твин пипеткой вносили 100 мкл / лунку козьего античеловеческого IgG, конъюгированного с щелочной фосфатазой и разбавленного до 1: 500 (Sigma, St. Louis, MO, USA). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа, а затем снова трижды промывали. Затем добавляли 100 мкл / лунку раствора субстрата (1 мг / мл п-нитрофенилфосфата в 50 мМ буфера бикарбоната натрия, pH 9.6, содержащего 1 мМ хлорида магния). Цветную реакцию останавливали добавлением 20 мкл / лунку 1 н. NaOH и планшет считывали при 405 нм с использованием модели Microplate Reader 3550 (Bio-Rad, Ричмонд, Калифорния, США). После вычитания холостого опыта значения абсорбции преобразовывали в произвольные единицы EIA, иммуноферментный анализ: иммуноферментный анализ (0.01 OD = 1 единица EIA).
Анализ иммунофиксации первоначально был проведен в соответствии с методикой, опубликованной нами (17-20), используя MPR или MBP (главный основной белок: главный основной белок) в качестве антигенов для скрининга и предварительно окрашенные белки (предварительно окрашенный) стандарта (Bio -RAD). Короче говоря, белки были разделены в 12% -ный раствор готов к использованию геля (Bio-Rad) с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с использованием (PAGE) и додецилсульфат натрия (SDS)6, Затем они были перенесены на нитроцеллюлозные мембраны с использованием двойной методики сэндвич с последующим блокированием с 1% в физиологическом растворе трис-буфера, бычьего сывороточного альбумина (TBS: Трис-буферном солевом растворе). Мембраны высушивали на воздухе и помещали при комнатной температуре.
Для иммунологических тестов небольшие блоты диаметром 3-4 мм инкубировали в течение одного часа с соответствующим образом разведенной сывороткой от аутичных или контрольных пациентов. После четырех промывок TBST (трисы-буфер солевого раствора, содержащий 0,05% твин-20), блото инкубировал в течение одного часа с поливалентными иммуноглобулинами анти-человеческий IgG, конъюгированный с щелочной фосфатазой козий (щелочной фосфатазы конъюгированного козьим анти-человеческим поливалентными иммуноглобулины) (сигма). После четырех промывок TBST блоты проявляли в растворе субстрата в соответствии с инструкциями производителя набора субстратов AP (щелочная фосфатаза) (Bio-Rad). Реакция считалась положительной, только если была показана сине-фиолетовая полоса. В некоторых экспериментах, присутствие вирусных белков в MPR-блоттинга было установлено, с помощью моноклональных антител против MV гемагглютинина (HA), нуклеопротеид MV-NP, RV или MUV (Chemicon International, Temecula, Калифорния., США), а затем иммунологический поиск через щелочную фосфатазу козьего анти-мышиного IgG; для всех других тестов вышеуказанные условия были повторены. Для того, чтобы определить молекулярную массу, мы провели одновременное стандартных белков SDS-PAGE precoloured (Bio-Rad) с включенным миозина (207 кДа), бета-галактозидазы (121 кДа), бычий сывороточный альбумин (81 кД), овальбумин (51.2 кД ), карбоангидразы (33.6 кДа), ингибитор rizina сои (28.6 кДа), лизоцим (21.1 кДа), и апротинин (7.5 кДа).
Результаты
Прежде всего, важно подчеркнуть тот факт, что мы выбрали MPR в качестве антигена для скрининга просто потому, что он является иммунизирующим антигеном при вакцинации детей MPR. Таким образом, антитела к МНР будет точным, пригодный для этой конверсии сыворотки три- или поливалентной вакцины, вместо антител против вирусных белков против кори, эпидемического паротита и краснухи индивидуально используется для измерения серологических вируса в рутинной практике. Первоначально для изучения влияния разбавления сыворотки, уровень MMR антител измеряли с помощью ELISA сывороток из 24 детей, страдающих аутизмом, 14 нормальных детей и 16 детей с другими проблемами, кроме аутизма. Результаты теста ELISA на уровни антител к сыворотке MPR суммированы на рисунке 1.
Рис 1 Обнаружение антител MPR с помощью теста ELISA. Уровни антител MPR показаны в соответствии с разведением сыворотки для детей с аутизмом (n = 24, кружки в верхней строке), нормальных детей (n = 14, квадраты в центральной линии) и детей с другие проблемы со здоровьем (n = 16, треугольники, в нижней строке). По статистике, по оценке испытаний студентов, уровень антител MMR значительно выше у детей, страдающих аутизмом. Данные выражены стандартной ошибкой ± (Standard Error SE).
У детей с аутизмом, у которых сыворотка крови тестировалась в различных разведениях, уровень антител к MPR был значительно выше, чем у нормальных детей и детей с другими проблемами. наблюдались основной пик (более чем в семь раз) при разведении сыворотки 1:50 аутизма. Метод ИФА был в основном используется для определения соответствующего разведения сыворотки, которую затем оценивали, как 1:50. Впоследствии, все сыворотки были проанализированы в этом разведении через «анализа иммунофиксации, так как этот метод позволяет анализ белков, которые связываются с антителами, что было основной целью настоящего исследования.
Анализ иммунофиксации всех 217 сывороток показал, что 75 из 125 аутистических сывороток, против ни одной из 92 контрольных сывороток, имели антитела против MPR и MBP. Как показано на рисунке 2, аутистические сыворотки immunopositiva имели реакцию на полосу 73-75 кДа белков в MPR-блоттинге (фиги. 2, линия В), в то время как реакции не имеют такой контроль сыворотки (рис. 2, строка А); никакие другие белковые полосы не были иммунопозитивными в этом анализе. Кроме того, та же самая полоса белка в блотах MPR имела иммунопозитивную реакцию на моноклональные антитела MV-HA (фиг. 3, левая линия), но не на моноклональные антитела MV-NP (фиг. 3, правая линия). Блоты были МНР immunonegativi с моноклональными антителами RV или MUV (рисунок 4). В соответствии с предыдущими исследованиями [5, 15, 19, 20], аутистические сыворотки содержали аутоантитела к MBP от 18,5 до 20 кДа (фигура 2, линия D), которые молекулярный вес мозга головного мозга MBP использовали в настоящем исследовании. Контрольные сыворотки были отрицательными в отношении аутоантител к МВР (фигура 2, линия C).
На основе анализа иммунофиксации, мы обнаружили, что 75 из 125 (60%) детей, страдающих аутизмом были положительными на MPR антител в то время как 70 из 125 (56%) детей, страдающих аутизмом имели аутоантитела MBP (рис. 5). Ни один из этих двух типов антител были обнаружены в контрольной группе (здоровые дети или с другими типами болезни). Кроме того, по данным нашего анализа иммунофиксации, группа детей, страдающих аутизмом обнаружило интересную корреляцию между MPR антител и аутоантител к ОБМ, т.е. более 90% от положительного аутистического сывороток к MPR антител также были положительными для аутоантител MBP (рис. 5 ). Эта корреляция отсутствовала в контрольной группе, так как дети в этой группе были отрицательными как для антител к MPR, так и для аутоантител к MBP.
Рис. 2. Иммуноблоты, представляющие MPR-антитела и MBP-аутоантитела. Как описано в тексте, белка в МНР пятнах и MBP инкубировали с аутистической сывороткой или контролем, и были изучены с помощью поливалентных иммуноглобулинов анти-человека, конъюгированных с щелочной фосфатазы козой. Следует отметить, что аутистические сыворотки (дорожки В и D), но не контрольные сыворотки (полосы А и С), показали антитело-положительные реакции с 73 белком при 75-кДе в MPR пятне и белком 18,5, От 20 до 12 кДа в месте MBP, соответственно. В геле 17,5% акриламид, МНР Полоса белка (Rf = 16,4 мм) переносятся немного быстрее, чем бычий сывороточный альбумин (Rf = 161 мм) по сравнению с другими белковыми стандартами расфасованных (Cat. No. 0318-XNUMX, Bio-Rad).
Рис. 3. Репрезентативные иммуноблоты MPR реагировали с моноклональными антителами к белкам MV. Для этой цели МНР пятна инкубировали отдельно с двумя разведениями (1: 100 и 1:50) моноклонального антитела MV-HA-NP MV или моноклональных антител и детектируются с щелочной фосфатазы против мышиного IgG козы. Следует отметить, что моноклональное антитело MV-HA (полосы А и В), но не МВ-НП моноклональное антитело (полосы C и D), показал полосу реакции immunopositiva с 73 до 75 кДа-MPR пятно.
Рис. 4. Представитель иммуноблот МНР подвергают взаимодействию с моноклональными антителами к RV или MUV. МНР 4 отдельных сеансов ПААГ-ДСН пятна инкубировали с моноклональными антителами (разведение 1: 100) на колесах или MUV, и детектировали с щелочной фосфатазы козьего анти-мышиного IgG. Обратите внимание, что пятна MPR были отрицательными в этих иммуноанализах.
Рис. 5. Распределение антител к MPR и MBP у аутичных и контрольных детей. После того, как скрининг антител с помощью иммуноблоттинга, процент положительных сывороток с антителами была вычислена в каждой исследуемой группе. Это было прослежено против тестируемого источника антигена. Следует отметить, что только аутистическая группа показала положительные реакции (вертикальные столбики), но контрольная группа, которая входит нормальные ребенок (базовый блок 1), нормальные братья и сестры (основная коробка 2) и ребенок с другими заболеваниями (основная панелью 3) это было отрицательно.
нить
Несколько исследований во всем мире показали, что иммунные факторы, такие как аутоиммунитет, могут играть фундаментальную роль в патогенезе аутизма [10, 12, 14-17, 19, 20]. Имеются данные об иммуногенетических факторах восприимчивости [24] и групповой группе аутоиммунных заболеваний в семьях с аутичными детьми [4]. Аутичные дети имеют многочисленные иммунные нарушения: увеличение сыворотки IgG3 [16], снижение в сыворотке IgA [7,12], а также сокращение числа функций лимфоцитов, в частности, вспомогательные Т-клеток (CD4 +) и естественных клеток-киллеров (NK-клетки) [10, 12, 21, 23] и повышенные уровни в плазме аутоиммунное-специфических цитокинов, таких как интерлейкин-2, интерлейкин-12 и интерферона-гамма [4]. Повышенная частота определенных иммуногенетических факторов (C4B нуль-аллель, гаплотип продлила В44-ПК30-DR4 и HLA-DRB1 гипервариабельная область) также были показаны, в некоторых детях с аутизмом [24]. Многие аутичные дети имеют органоспецифичные аутоантитела, в частности, аутоантитела к белку MBP, производному от миелина, из мозга [15, 17, 19, 20]. Кроме того, значительное число детей, страдающих аутизмом показывают значительное улучшение характеристик аутистических при лечении иммунной терапии, такие как пероральный аутоантигенов [15], внутривенного иммуноглобулина [7] или коэффициента передачи [5]. В совокупности эти иммунные нарушения и / или иммунотерапия согласуются с аутоиммунной основой патогенеза аутизма.
Вирусы обычно связаны с аутоиммунными заболеваниями, несмотря на отсутствие экспериментальных данных. Спусковой механизм аутоиммунитета при аутизме неизвестен, но вирусные ассоциации были описаны [2, 8]. Аутичные дети имеют значительно более высокое значение, чем нормальные уровни антител к кори, но не антитела к ВГЧ-6, краснухе или цитомегаловирусу [15, 17]. Специфическое повышение уровня антител к кори также соответствовало серологической ассоциации между МВ и аутоиммунитетом при аутизме, что привело нас к постулированию этиологической связи между МВ и аутизмом [15, 17]. Как сообщалось здесь, у детей, страдающих аутизмом, обнаружено значительное повышение уровня антител к MPR. Кроме того, антитело MPR показало иммунопозитивную реакцию на белок MPR 73-75 кДа у 60% детей с аутизмом в исследовании. Это был важный результат, потому что молекулярная масса белка MPR, который положительно реагировал на антитела MPR, напоминала молекулярную массу белка кори, известного как антиген HA. Фактически, полоса MPR содержала антиген MV-HA, поскольку она была иммунопозитивной для моноклональных антител к MV-HA, но не для моноклональных антител к MV-NP. В предварительных данных, не включенных здесь, мы недавно обнаружили, что моноклональное антитело MV-HA, но не моноклональное антитело MVNP, почти полностью блокировало связывание антитела-положительного сывороточного антитела (MPR) с полосой белка MPR на иммуноблоте. Следовательно, эти косвенные исследования предполагают, что антитела MPR в аутистических сыворотках более вероятно будут направлены на антиген HA, чем MV. Кроме того, полоса MPR от 73 до 75 кДа не содержала RV или MuV, поскольку эта полоса была иммунонегативной по отношению к моноклональным антителам для каждого из этих двух вирусов. По сравнению с детьми, страдающими аутизмом, у контрольных детей были низкие уровни антител к MMR, которые были иммуноотрицательны к антигену MV-HA, полученному из MMR. Таким образом, представляется правдоподобным, что аутичные дети вызывали неуместный или ненормальный ответ антител на MDR, который был направлен против антигена MV-HA. Несомненно, необходимы дополнительные исследования по этой теме, но мы склонны предположить, что дефектные иммунорегуляции или иммуногенетические факторы могут определить, почему только аутичные дети продуцируют эти аномальные антитела к белку, полученному из MPR (73-75 кДа), который, по-видимому, является MV HA антиген. Альтернативно, различие между аутистическими и контрольными детьми может быть связано со структурной модификацией (или мутацией) антигенной детерминанты, распознаваемой антителами MPR. Иммунизация вакцинами является лучшей профилактической мерой против смертельных инфекций, доступных сегодня человечеству. Поскольку вакцины вводятся здоровым субъектам, почти исключительно детям, безопасность вакцин должна быть максимально возможной для человека. Хотя уравнение риска и пользы сильно благоприятствует вакцинации, существуют некоторые серьезные, хотя и крайне редкие, побочные эффекты, которые заслуживают научного внимания. Например, асептический менингит [6] и мозжечковая атаксия были описаны у детей, иммунизированных МПР. Тем не менее, основа того, как вакцины реагируют отрицательно в некоторых случаях, остается практически неизвестной. Вполне возможно, что вакцины в небольшой популяции генетически предрасположенных детей могут реагировать неадекватно, просто из-за их незрелой иммунной системы или других неизвестных факторов риска, таких как иммунодефицит, аллергия, химические токсины или хронический психологический стресс [3]. ,
В последние годы тема иммунизации-аутоиммунности заработал внимание немного»от общественности. Это, вероятно, связано с тем, что аутоиммунные заболевания являются наиболее распространенными проявлениями [1, 13] вакцинаций. МЛУ был признан виновным в желудочно-кишечных проблемах у некоторых детей с аутистическими характеристиками [22]. Около половины родителей с аутичными детьми сообщила аутичную регрессию после MMR иммунизации [17]. Кроме того, серологическая ассоциация МВ с аутоиммунитетом была обнаружена у детей, страдающих аутизмом, у которых не было коровой инфекции дикого типа, но иммунизировали MPR [17]. И, как описано здесь, аутичные дети показали серологическое корреляцию между MMR и аутоиммунности мозга, то есть более 90% положительных сывороток с аутизмом к MMR антител также имели мозг MBP аутоантител. Это наблюдение весьма интригующее в пользу связи между атипичный инфекцией корью и аутизмом; Атипичная инфекция обычно относится к инфекции, которая возникает при отсутствии сыпи. Недавно было описано, что атипичная корь при отсутствии сыпи и необычных неврологических симптомов предполагает наличие варианта МВ у детей и взрослых [9]. В свете этих новых результатов мы предполагаем, что значительный процент случаев аутизма может быть результатом атипичной инфекции кори, которая не вызывает сыпи, но вызывает неврологические симптомы у некоторых детей. Источником этого вируса может быть вариант MV или вакцина MPR. С научной точки зрения, поэтому, полезно рассмотреть обе эти возможности и обнаружить с помощью экспериментальных исследований. Мы считаем, что это чрезвычайно важная проблема общественного здравоохранения, просто потому, что некоторые ученые недавно предупредили нас о появлении мутантного MV, вызывающего смертельные заболевания у людей [9]. Если это так, то необходимо будет затем новые стратегии вакцинации против инфекции мутантных кори. Хотя дальнейшие исследования, чтобы установить патогномоничную роль MPR / MV, мы в настоящее время изучаем роль аутоиммунных заболеваний, вызванные вирусами и наше исследование будущего призвано характеризовать молекулярную основу клеточного и гуморального иммунитет к вирусным антигенам у детей необходимы с аутизм.
источник: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12145534
Перевод Николетты Протти и Клаудио Андреини Ди Вита, Клива Тоскана