Приорикс тетра генома человека и клеточная линия MRC-5 - сравнительное исследование

Приорикс тетра генома человека и клеточная линия MRC-5 - сравнительное исследование

Краткое представление результатов

Сегодня мы представляем дальнейшее и очень важное углубленное исследование по геномному секвенированию клеточной линии, которую мы обнаружили в четырехвалентной вакцине MPRV (корь, краснуха, эпидемический паротит и ветряная оспа) Priorix Tetra®, и исследование линии клеток MRC-5 ( тот, который якобы использовался при разработке самой вакцины).

Подведение итогов предыдущих опубликованных отчетов:

  1. Во-первых, мы продемонстрировали, что количество ДНК, присутствующей в вышеупомянутой вакцине, значительно превышает допустимый порог;
  2. Во-вторых, мы убедились, что клеточная линия фактически является заявленной MRC-5; 2
  3. Наконец, мы провели секвенирование генома клеточной линии, непосредственно выделенного из вакцины, выделив основные мутации, которые открывают возможность серьезного риска для здоровья при использовании этой вакцины.

То, что мы представляем здесь, - это как раз сравнительная работа между двумя геномами: тот, который мы фактически нашли внутри вакцины, и тот, который мы приобрели в международном банке клеточных линий как MRC-5.

В результате две линии демонстрируют важные различия с точки зрения генетической стабильности. В частности, геном вакцины значительно модифицирован по сравнению с клеточной линией, зарегистрированной в 1966 году.

Это означает, что производители, в данном случае Priorix Tetra®, приобрели клеточную линию в оптимальных условиях с точки зрения генетической стабильности и, благодаря продолжительному непрерывному использованию в производственных целях, выпускают на рынок вакцины, содержащие все больше и больше модифицированный генетический материал человека, который опасен для здоровья самих вакцинируемых.

Поскольку регулирующие органы не требуют периодического мониторинга генетической стабильности линий плода и даже не устанавливают минимальный порог безопасности, мы можем сделать вывод, что фундаментальные требования к качеству и безопасности вакцин, полученных из линий клеток человека, не были выполнены для Некоторое время спустя, а именно необходимость убедиться, что они не развивают потенциально опасные мутации и перестройки и обеспечить устранение остатков процессинга генетического материала, если они присутствуют.

Мы не несем ответственности за определение того, какая часть процесса производства или консервации может повлиять на качество и безопасность продукта, но то, что мы можем подтвердить сегодня, публикуя этот отчет, является настоятельной необходимостью провести углубленное изучение результатов нашего анализа. в течение последних двух лет мы уведомляли, концентрируясь на готовом продукте, продаваемом и управляемом, а не только на единичных утвержденных «ингредиентах».

Мы хотели бы еще раз напомнить, что эти продукты являются частью итальянского графика вакцинации и в настоящее время распространяются на детское население в нашей стране, а также в других европейских странах и в целом по всему миру.

Регулирующие органы несут огромную ответственность за безопасность, что в настоящее время выражается словами, но на практике и, как показывает наш анализ, не может быть гарантировано и фактически не гарантировано.


Круговой показ геномов (цирковой сюжет)

Графическое представление двух геномов, называемых «цирковой сюжет», показано ниже.

Corvelva MRC5 1

Объяснение различных концентрических кругов

  1. Внешний круг (первый круг) - это номер хромосомы.
  2. Второе кольцо (синее) представляет охват чтения стиля гистограммы. Каждая гистограмма представляет собой среднее покрытие области 0.5 Мбит / с.
  3. Третье кольцо (черное) представляет плотность INDEL в стиле «дисперсионный график». Каждая черная точка рассчитывается как количество INDEL (небольших вставок / удалений) в диапазоне 1 Мбит / с.
  4. Четвертое кольцо (зеленое) представляет плотность snp в стиле «дисперсионный график». Каждая зеленая точка рассчитывается как количество SNP (вариантов одного нуклеотида) в диапазоне 1 Mbp.
  5. Пятое кольцо представляет долю SNP в стиле гистограммы гомозиготности (оранжевый) и гетерозиготности (серый). Каждая гистограмма рассчитывается из области 1 Мбит / с.
  6. Шестое кольцо представляет собой вывод CNV (варианты в количестве копий). Красный означает получение кусочков ДНК, а зеленый означает потерю.
  7. Самое центральное кольцо представляет собой вывод SV (структурных вариантов) в гексагональной и сплайсинговой областях. TRA (оранжевый, транслокации), INS (зеленый, вставки), DEL (удаления, серый), DUP (дублирование, розовый) и INV (инверсия, синий).

Заключение

Два генома показывают важные различия. В частности, геном вакцины, по-видимому, серьезно мутировал по сравнению с клеточной линией, депонированной в 1966 году. Надо сказать, что у нас не было возможности секвенировать клеточную линию, используемую GlaxoSmithKline для производства вакцины Priorix Tetra®, но один из оригинального запаса.

Фармацевтические компании, использующие клеточные линии для производства лекарств и вакцин, имеют собственную линию MRC-5, но этот факт не меняет наших сомнений, то есть нет периодического запроса на мониторинг генетической стабильности, и это является серьезной проблемой в нашем вид, тем более что это разрешено без ограничения порога.


Скачать: CORVELVA-Приорикс-Тетра-человек-генома и-MRC-5-клеточного line.pdf


Приорикс Tetra® человеческий геном и клеточная линия MRC-5 - сравнительное исследование (стандарт ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

Присутствие вируса краснухи было продемонстрировано секвенированием библиотеки RNA-seq с чрезвычайно большой глубиной (приблизительно 260 миллионов последовательностей, полученных Illumina). Было обнаружено 114 последовательностей из 260 миллионов, что составляет 0.00004% от общего числа последовательностей. Затем последовательности генома краснухи были подтверждены вручную с помощью программного обеспечения BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Библиотека, секвенированная на более низкой глубине (около 12 миллионов совпадающих последовательностей Illumina, равных 6 миллионам фрагментов библиотеки, секвенированной) не обнаружила присутствия ЛЮБЫХ чтений, относящихся к краснухе, в этой партии.

Другие последовательности вируса, присутствующие в вакцине (ветряная оспа, корь и эпидемический паротит), также были проверены тем же ручным способом, подтверждая, что они были правильно назначены.


Введение

Секвенсоры нового поколения стали инструментами выбора для детального анализа в области биологии и медицины, особенно точного. Эти инструменты позволяют использовать новый и более глобальный подход к ряду приложений, таких как секвенирование de novo, метагеномика, эпигеномика, секвенирование транскриптома и повторное секвенирование генома.

Последнее применение (повторное секвенирование) широко распространено в человеческой области как в исследовательских, так и в диагностических целях и состоит в секвенировании с использованием технологии NGS (Next Generation Sequencing) всего индивидуального генома для картирования одиночных нуклеотидных мутаций (SNP, произношение ' snip '), вставки и делеции более или менее длинных последовательностей происходили в определенных положениях генома и различались по количеству копий частей генома / генов (CNV, варианты числа копий).

Процедура секвенирования требует, чтобы ДНК человека была механически разбита на фрагменты небольшого размера (400-500 п.н.), и эти фрагменты связаны с участками искусственной ДНК, называемыми адаптерами, которые позволяют фиксировать фрагменты ДНК человека на поверхности стекла. на которых затем читаются основания (A, C, G, T).

Чтение ДНК получают путем включения химических реакций нуклеотидов, меченных флуоресцентными молекулами. Миллионы последовательностей (считываний), которые получены секвенированием, произошли на поверхности стекла, затем сопоставляются с эталонным геномом человека с помощью соответствующего программного обеспечения, и затем идентифицируются все варианты, присутствующие в анализируемом геноме, по сравнению с эталонным.

Эта же процедура была выполнена для человеческого генома, присутствующего в Priorix Tetra®, партия n. A71CB256A и ДНК, выделенной из клеточной линии MRC-5, зарегистрированной в 1966 году в ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC является ведущей всемирной организацией ресурсов и стандартов биологических материалов, миссия которой сосредоточена на приобретении, аутентификации, производстве, сохранении, разработке и распространении эталонных микроорганизмов, клеточных линий и других биологических стандартных материалов. Он был создан в 1925 году, когда комитет ученых признал необходимость централизованного сбора биологических материалов, которые могли бы служить ученым во всем мире.

Клеточная линия MRC-5 получена из нормальной ткани легкого мужского плода 14-недельного возраста и была депонирована в ATCC JP Jacobs в сентябре 1966 года. Утверждается, что эти клетки могут удвоиться от 42 до 46 популяций до старения. начинается. Справочная статья для этой клеточной линии восходит к 1970 году: https://www.nature.com/articles/227168a0


Результаты

Как было показано ранее, ДНК человека присутствует в Priorix Tetra® много. п. A71CB256A (обозначенный на следующих графиках как «образец ID12051PT») представляет собой полный индивидуальный геном, то есть присутствует геномная ДНК всех хромосом индивидуума мужского пола. Графики покрытия (средняя глубина = среднее покрытие) 22 хромосом человека и хромосом X и Y показаны ниже для вакцины (изображение выше) и клеточной линии MRC5 (изображение ниже).

Corvelva MRC5 1

Ниже приведены результаты анализа различных типов вариантов.


Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) и короткие вставки / делеции (InDels)

Варианты отдельной индивидуальной ДНК (SNP, произносится как «snip») являются полиморфизмами, то есть вариациями генетического материала, переносимого одним нуклеотидом. InDels - это небольшие вставки и делеции длиной менее 50 п.н., которые составляют еще один класс геномных вариантов в геноме человека.

SNP (однонуклеотидный полиморфизм) - ID12051PT

Corvelva MRC5 1


SNP (однонуклеотидный полиморфизм) - MRC-5

Corvelva MRC5 1


InDels (короткие вставки / удаления) - ID12051PT

Corvelva MRC5 1


InDels (короткие вставки / удаления) - MRC-5

Corvelva MRC5 1


CNV (варианты количества копий) и SV (структурные варианты)

Варианты числа копий (CNV) являются геномными вариантами из-за различий в количестве копий относительно крупных фрагментов (более 50 п.н.) в отдельных геномах. Существует два типа CNV: тип усиления (усиление копий) и тип потерь (потеря копий).

Структурные варианты (SV) - это геномные варианты с относительно большими размерами (> 50 п.н.), включая делеции, дупликации, вставки, инверсии и транслокации.

CNV (варианты номера копии)

Corvelva MRC5 1

Corvelva MRC5 1


SV (структурные варианты)

Corvelva MRC5 1Corvelva MRC5 1


Круговая визуализация геномов (цирковой сюжет)

Графическое представление двух названных геномов (круговой график) показано ниже.

Corvelva MRC5 1

Corvelva MRC5 1


Значение различных концентрических кругов

  1. Внешний круг (первый круг) - это номер хромосомы.
  2. Второе кольцо (синее) представляет охват чтений в стиле гистограммы. Каждая гистограмма представляет собой среднее покрытие области в 0,5 Мбит / с.
  3. Третье кольцо (черное) представляет плотность INDEL в «стиле графика рассеяния». Каждая черная точка рассчитывается как количество INDEL (небольших вставок / удалений) в диапазоне 1 Мбит / с.
  4. Четвертое кольцо (зеленое) представляет плотность snp в стиле дисперсионного графа. Каждая зеленая точка рассчитывается как число SNP (однонуклеотидных полиморфизмов) в диапазоне 1 Мбит / с.
  5. Пятое кольцо представляет соотношение гомозиготного (оранжевого) и гетерозиготного (серого) SNP в стиле гистограммы. Каждая гистограмма рассчитывается из области 1 Мбит / с.
  6. Шестое кольцо представляет собой вывод CNV (варианты количества копий). Красный означает, что кусочки ДНК получают, а зеленый означает потерю.
  7. Самое центральное кольцо представляет собой вывод SV (структурные варианты) в экзонической и сплайсинговой областях. TRA (перемещение, оранжевый), INS (вставки, зеленый), DEL (удаление, серый), DUP (дублирование, розовый) и INV (инверсия, синий).

Выводы

Эти два генома показывают важные различия. В частности, геном вакцины оказывается сильно измененным по сравнению с геномом клеточной линии, депонированной в 1966 году. Следует сказать, что у нас не было возможности выполнить секвенирование клеточной линии, используемой GlaxoSmithKline для производства вакцина Priorix Tetra®, но оригинальная. Фармацевтические компании, которые используют клеточные линии для производства лекарств и вакцин, имеют свою собственную линию MRC-5, но это не меняет наших подозрений, то есть тот факт, что контроль генетической стабильности не требуется периодически, очень серьезен, по нашему мнению, особенно потому, что это разрешено присутствовать без предельного порога.


выводы

Два генома показывают важные различия. В частности, геном вакцины оказывается сильно измененным по сравнению с геномом клеточной линии, депонированной в 1966 году. Надо сказать, что у нас не было возможности секвенировать клеточную линию, которая используется GlaxoSmithKline для производства вакцины Priorix Tetra, но как у стоковой оригинал. Фармацевтические компании, которые используют клеточные линии для производства лекарств и вакцин, имеют свою линию MRC-5, но это не меняет наших подозрений, то есть тот факт, что контроль генетической стабильности не требуется периодически, и это очень серьезно, по нашему мнению прежде всего потому, что он может присутствовать без ограничений.