Технический ответ на критику доктора Буччи

Технический ответ на критику доктора Буччи

Ниже мы сообщаем о техническом ответе доктора Лоретты Болган на критику, опубликованную доктором Буччи в отношении анализов Корвельвы.


Уважаемый доктор Bucci,

ниже я отвечаю на критические вопросы, которые вы затронули, в частности, в вашей статье, опубликованной на: CattiviScienziati.com

Прежде всего, я хотел бы отметить, что использование технологий NGS / HTS (секвенирование следующего поколения или высокопроизводительная секвенирование) НЕ является оригинальным на сложных субстратах биотехнологического происхождения, таких как вакцины.

Технология NGS уже используется в вакцинных продуктах, например:

  • в анализе коммерческих партий ротавирусной вакцины (Victoria JG, Wang C, Jones MS, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S и др. Вирусные нуклеиновые кислоты в живых ослабленных вакцинах: обнаружение вариантов меньшинства и случайного вируса. J Virol 2010; 84: 6033–40) разрешение последующей блокировки сбыта партий, зараженных цирковирусом свиного типа 1 (PCV1), несмотря на то, что ранее они прошли все тесты, необходимые для разработки, клинических испытаний и производства (Dubin, G.; Toussaint, JF; Cassart, JP; Howe, B;; Boyce, D.; Friedland, L.; Abu-Elyazeed, R.; Ponlace, S.,; Han, HH; Debrus, S. Расследование расследования регулирующего органа в отношении потенциального типа цирковируса свиней 1 Загрязнение ротавирусной вакцины человека, Rotarix: подход и результаты. Hum. Vaccines Immunother. 2013, 9, 2398–2408).

  • в обнаружении нового рабдовируса в клеточной линии Sf9 (М.Х., Галвин Т.А., Гласнер Д.Р., Шахедуццаман С., Хан А.С. Идентификация нового рабдовируса в клеточных линиях Spodoptera frugiperda. J Virol 2014; 88: 6576–85)

  • при выявлении вируса паротитной вакцины в головном мозге ребенка с ослабленным иммунитетом, умершего от энцефалита (Морфопулу С., Ми Э.Т., Коннотон С.М., Браун Дж.Р., Гилмор К., Чонг В.К., Дюпрекс В.П., Фергюсон Д., Хубанк М., Хатчинсон С., Калиакатсос М., Маккуэйд С., Пейн С., Планьоль В., Руис С., Вирасами А., Жан Н, Жак Т.С., Шепельман С., Касим В., Брейер Дж. Глубокое секвенирование выявляет стойкость связанного с клетками вируса эпидемического паротита при хроническом энцефалите. Acta Neuropathol. 2017 Jan; 133 (1): 139-147. Doi: 10.1007 / s00401- 016-1629-й, Epub 2016, октябрь 21. PubMed PMID: 27770235).

Кроме того, в совместной работе 2017 года «Многоцентровое исследование для оценки эффективности высокопроизводительного секвенирования для обнаружения вирусов» (А. Х.С., Н. Г. Ш. С., Вандепутте О, Альджанахи А., Дейати А., Кассарт Дж. П., Чарлбуа Р. Л., Талиаферро Л. П. А Многоцентровое исследование для оценки производительности высокопроизводительного секвенирования для обнаружения вирусов. MSphere. 2017 г. сентябрь 13; 2 (5) .pii: e00307-17. Doi: 10.1128 / mSphere.00307-17. ECollection 2017 сентябрь-октябрь PubMed PMID : 28932815; PubMed Central PMCID: PMC5597969), рассказывает о том, как анализы, выполненные с использованием различных инструментов HTS, с различными протоколами подготовки образцов и анализа данных, на образцах, имитирующих сложные биологические материалы, продемонстрировали аналогичную чувствительность при обнаружении вирусов в 3. несколько мастерских.

Наконец, в «Отчете международной конференции по секвенированию следующего поколения для обнаружения случайных вирусов в биологических препаратах» (Хан А.С., Бенетти Л., Блюмель Д., Дефорс Д., Эган В.М., Кнежевич И., Краузе П.Р., Маллет Л., Майет Д., Минор П.Д. , Neels P, Wang G. Отчет международной конференции по секвенированию следующего поколения для обнаружения случайных вирусов в биологических препаратах. Biologicals. 2018 Sep; 55: 1-16. Doi: 10.1016 / j.biologicals.2018.08.002. Epub 2018 Aug 6 PubMed PMID: 30093175), отчет о международной конференции, состоявшейся в Роквилле (Мэриленд) с 26 по 27 октября 2017 года, совместно организованной IABS (Международный альянс по биологической стандартизации) и FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США), в В нем приняли участие сто двадцать восемь ученых из 16 разных стран, включая исследователей Glaxo SmithKline, Merck и Sanofi, и заявлено, что:

«Основными преимуществами NGS для тестов безопасности для обнаружения вирусов являются быстрый и нецелевой подход, который можно использовать на нескольких субстратах и ​​который позволяет обнаруживать широкий спектр вирусов, включая варианты и новые виды. ; и что нет необходимости в специфической амплификации, в то время как ПЦР требует нацеливания на конкретную последовательность ».

И еще:

«Технологии HTS выявляют некоторые из существующих ограничений программ для тестирования биологических материалов и могут интегрировать пробелы в эти программы и повысить безопасность продукции»

И в выводах доклада мы читаем:

«Непрерывные совместные и научные усилия, обмены между регулирующими органами и другими государственными органами, промышленностью, академическими лабораториями и поставщиками услуг будут способствовать развитию области NGS с целью обеспечения безопасности органических продуктов, влияющих на здоровье человека и животных».

Ниже я отвечу на ваши наблюдения, в частности на те, которые позволяют нам лучше объяснить предварительные данные, которые мы получили по некоторым партиям Priorix Tetra.


Замечание 1

«Интересно, как эта практика секретности, вопреки любому критерию обмена данными, может быть согласована с постоянными запросами о прозрачности, сделанными ассоциацией CORVELVA и президентом Национального ордена биологов в отношении безопасности вакцин: это законно запустить сигнализацию, не предоставив все данные, необходимые для оценки его согласованности?
Как научное сообщество и граждане могут оценить вес определенных претензий, если полные исходные данные хранятся в секрете, пока государственный прокурор не решит, следует ли и как поступить с судебным иском? "

Ответ 1

Данные метагеномики, раскрытые Corvelva для Priorix Tetra (вакцина MPRV) и обсужденные в отчете, опубликованном в декабре, были предварительными (обновленная версия была опубликована на веб-сайте Corvelva 23 января, в результате еще одного шага в анализе данных), потому что, как уже неоднократно подтверждалось, данные, раскрытые до настоящего времени, являются результатом процесса исследований и технологического развития, начатого в 2017 году, с целью тонкой настройки и оптимизации всей процедуры, от обработки образца до анализа биоинформатики. Было решено разглашать результаты в ходе работы по мере их появления в абсолютной прозрачности (прямо противоположно тому, что вы объявляете «практикой секретности»!), И в любом случае решительно поддерживается научной литературой о «аргумент.

По нашему мнению, то, что мы раскрыли до сих пор об этой вакцине, особенно относительно большого количества человеческой эмбриональной ДНК, не является чем-то новым или неожиданным и, что менее всего, неизвестно фармацевтическим компаниям.


Замечание 2

«Легко видеть, что общее количество чтений, указанных в левом верхнем углу (выделено желтым цветом), составляет более 6 миллионов; однако сумма всех операций чтения, разделенных на классы организмов, составляет приблизительно 5 с половиной миллионов, при этом «дефицит» составляет более 700.000 88 операций чтения (и процентная сумма, обозначенная красной рамкой, равна XNUMX%). Это простое дополнение, повторяемое во всех таблицах, задает вопрос о том, где закончились пропущенные чтения (процент, который, безусловно, не является незначительным) и почему о них не сообщалось. Возможность того, что исследователи допустили ошибку, остается явно открытой »

Ответ 2

Допустим, что 700.000 XNUMX считываний более или менее незначительно изменяют содержание проведенных предварительных анализов. Недостающие последовательности включаются в вычисление «неназначенных» последовательностей. Как уже упоминалось, данные не являются окончательными, и в отчетах могут быть неточности. Все будет пересмотрено и исправлено по ходу работы.


Замечание 3

«Генома вируса краснухи, одного из аттенуированных вирусов, необходимых для придания иммуногенности, не будет. Таким образом, обнаружение микроорганизма в исследуемом образце на очень низких уровнях при пределе статистического шума зависит не от его отсутствия, а от неоптимизированного метода идентификации. Та же самая идентичная трудность может возникнуть при идентификации любого другого генома, для которого метод анализа не был должным образом откалиброван; Поэтому неспособность выявить геном вируса краснухи (плюс один инкапсулированный вирус спирали) объясняется используемым методом без необходимости ссылаться на его отсутствие в исследуемых партиях вакцин ».

Ответ 3

Его тезис приемлем. Мы находимся в стадии исследований и разработок, однако технология очень надежна и признана научным сообществом, которое занимается глубоким секвенированием для обнаружения вирусов в сложных биологических субстратах. Межлабораторные тесты и внедрение соответствующих сертифицированных стандартов на вирусную смесь позволят нам проверить или опровергнуть предложенную вами гипотезу, то есть то, что метод (пока) не оптимизирован для вирусов.

В любом случае геном краснухи был затем обнаружен в исследуемой партии, увеличивая глубину секвенирования (114 парных последовательностей длиной 125 п.н. из примерно 260 миллионов полученных последовательностей), как описано во втором отчете за январь 2019 года. Также в вакцине MMRVax Pro от Merck, проанализированный в 2017 году с помощью того же метода, обнаружил геном вируса краснухи без необходимости углубляться в такие глубокие глубины, доказывая, что метод работает.


Замечание 4

«Будут обнаружены геномы многочисленных загрязняющих организмов, принадлежащих к многочисленным таксонам, включая гельминты, бактерии и случайные человеческие патогенные вирусы. Существует также еще одна проблема в представленных таблицах, состоящая в обильной частоте последовательностей, относящихся к вирусам, интегрированным в геном человека (эндовирусы различной природы), или ретровирусным последовательностям, о которых известно, что они обнаружены в нормальном геноме человека (например, в случае последовательностей). интегрированные ретровирусные препараты, которые могут быть ошибочно приняты за ВИЧ) или в геноме куриных эмбриональных клеток, используемых для производства вакцины, как правило, обнаруживаются как ложные присвоения загрязняющим геномам при секвенировании ДНК или РНК в зависимости от конкретной рассматриваемой эндосепоследовательности. Прежде всего, есть многочисленные виды, перечисленные в таблицах отчета, которые найдены на основе количества чтений, полностью включенных в статистический шум. 3 или менее чтения - рискованная процедура, которая приводит к большому количеству ложных срабатываний ».

Ответ 4

Версия отчета, опубликованная на веб-сайте Corvelva в декабре, на которую вы ссылаетесь, недавно была обновлена ​​версией, в которой часть загрязняющих веществ была предварительно проверена с помощью альтернативного программного обеспечения, а затем вручную. Первый анализ был преднамеренно выполнен без фильтров, чтобы выделить все возможные сигналы и все проблемы, связанные с «открытым» анализом. Целью нашей работы является, как неоднократно повторялось, проведение анализа выпуска партии, а проведение предварительного скрининга и последующего межлабораторного подтверждения по возникшим критическим проблемам посредством использования устоявшейся технологии на местах. геномные, уже применяемые в вакцинах и готовящиеся также регулирующими органами и крупными фармацевтическими компаниями для повышения качества и, следовательно, безопасности продукта.

Если вы определите предел в 3 чтения (на основании чего?), То мы можем, по крайней мере, думать, что признаки присутствия эндогенных ретровирусов в этой вакцине вероятны (Эндогенный ретровирус человека K: 32 чтения 125 bp, что соответствует 4000 bp и HERVH- env 62: 4 читает, что соответствует 500 bp), в данных RNA-seq, которые по определению представляют транскрибированный и, следовательно, потенциально активный материал.

Вместо этого я согласен с вами, что ретровирусные последовательности, обнаруженные в данных DNA-seq, могут быть провирусами, интегрированными в геном человека, учитывая очень высокое количество человеческой ДНК в рассматриваемой вакцине.

Я помню, что в вакцине Attenuvax (противокоревая вакцина) 4 последовательности, охватывающие 700 п.н. (Виктория Дж. Г., Ван К., Джонс М.С., Джейнг С., Маклафлин К., Гарднер С. и др. Вирусные нуклеиновые кислоты в живых ослабленных вакцинах: обнаружение варианты меньшинства и случайный вирус. J Virol 2010; 84: 6033–40) позволил NGS впервые обнаружить заражение вирусом птичьего лейкоза (ALV) в вакцине, а затем подтвердить с помощью вложенной ПЦР.


Замечание 5

«Что касается первого из этих потенциальных загрязнителей, непатогенной азотфиксирующей бактерии Bradyrhizobium, ее« появления »в секвенирующих лабораториях это хорошо известно как проблема, связанная с подготовкой образцов для секвенирования, что связано с загрязнением наборов для очистки ДНК, воды и реагентов, которые будут использоваться. Хорошо известная проблема, при которой в работе «исследовательской» геномики контрольный образец, например содержащий воду, секвенируется параллельно исследуемому образцу ».

Ответ 5

Белые были получены (как из экстракции, так и из библиотеки), но библиотеки не были получены, и поэтому было невозможно запустить их на секвенсоре, чтобы точно проверить, что представляет собой загрязнение реагентом / окружающей средой. Однако предпринимаются усилия, чтобы попытаться понять, что такое «физиологические» загрязнения, и межлабораторные анализы также помогут определить возможные лабораторно-зависимые бактериальные загрязнения.


Замечание 6

«Что касается двух типов червей, выявленных в анализе секвенирования РНК, достаточно наблюдать, как они не присутствуют в соответствующих анализах секвенирования ДНК, где они должны быть намного лучше обнаруживаемыми; следовательно, фактическое присутствие этих двух видов проявляется как артефакт, который не может быть подтвержден в свете тех же данных секвенирования ДНК, представленных.

В свете сделанных соображений, следовательно, невозможно подтвердить наличие какого-либо из зарегистрированных загрязняющих геномов, и существуют сильные подсказки, которые заставляют нас задуматься о наличии многочисленных ложных срабатываний ».

Ответ 6

Вторая версия отчета уже предусматривала первую проверку некоторых обнаруженных организмов, как с помощью альтернативного программного обеспечения, так и вручную.

Оценка неправильных атрибутов программного обеспечения Kraken (более того, одного из наиболее часто используемых в научном сообществе программного обеспечения для метагеномного анализа всего генома) используется для разработки специального конвейера биоинформатики для такого типа анализа, который не требует использования других. программное обеспечение и ручная проверка (более того, распространенная в области метагеномики для современных проблем из-за отсутствия конкретных и особенно точных баз данных).


Замечание 7

«Обнаруженная человеческая ДНК будет иметь высокую молекулярную массу, и охват человеческого генома будет полным, так что весь геном человеческих эмбриональных клеток, а не его части, будет присутствовать в исследуемых партиях вакцин».

«В вакцине Priorix Tetra геномная ДНК человека имеет высокую молекулярную массу (> 10.000 19 п.н.), и общий охват последовательности всего эталонного генома человека (HG-XNUMX) показывает, что это весь геном фетальных клеток, используемый для культура вакцинных вирусов, а не только ее части. "

Прямое доказательство этого заявления не приводится, без ущерба для присутствия ДНК весом около 100.000 XNUMX оснований, выявленной авторами гель-электрофорезом (задокументировано с низким качеством в документе CORVELVA, из которого было бы желательно получить оригинал высокого качества). решение оценить, представлены ли данные в неизменном виде).

Однако авторы забывают, что ДНК некоторых аттенуированных вирусов, присутствующих в рассматриваемой вакцине, имеет примерно тот же размер, что они обнаружили в геле (например, ДНК вируса ветряной оспы составляет 125 кб); следовательно, даже если вы хотите заметить след ДНК с высоким весом на представленном изображении геля, это можно отнести к ДНК ослабленных вирусов, присутствующих в вакцине, а не к фрагментам человеческой ДНК. Опять же, мы столкнулись с чрезмерной интерпретацией экспериментального результата. Что касается второго элемента, на котором основано утверждение CORVELVA, то есть того, что весь геном человека будет присутствовать в вакцинах, мы помним, что даже нет необходимости иметь доступ к подробным данным о покрытии, чтобы взвесить его последовательность: глубина использованного секвенирования и количество полученных прочтений, это утверждение совершенно неправдоподобно. Кроме того, используемая методика секвенирования, основанная на коротких последовательностях, 125 нуклеотидов, не позволяет определить, фрагментирован ли геном. Используемая методика секвенирования позволяет только оценить долю секвенированной геномной ДНК ».

Ответ 7

ДНК человека в этой вакцине составляет приблизительно 8: 1 по отношению к ДНК ветряной оспы (88% считываний имеют человеческое происхождение, по сравнению с 11% ветряной оспы в последней проанализированной партии A71CB256A). Другие ослабленные вирусы дцДНК не присутствуют в вакцине, поскольку вирусы кори, эпидемического паротита и краснухи представляют собой одноцепочечные РНК-вирусы, которые нельзя увидеть на агарозном геле. NGS является количественной технологией, поэтому простое флуориметрическое количественное определение всей ДНК, выделенной из вакцины (например, партия. A71CB256A = 3,7 микрограмма на дозу), связанное с рассмотрением относительного количественного определения, сделанного выше (8: 1), позволяет нам чтобы можно было сказать, что клеточная ДНК составляет примерно 2,9 микрограмма на дозу, по сравнению с примерно 0.74 микрограмма ДНК ветряной оспы. Поэтому вполне вероятно, что, по крайней мере, часть высокомолекулярной ДНК, видимой на геле, может принадлежать клеткам линии эмбриональных клеток MRC5.

Прямое доказательство того, что в этом продукте присутствует ПОЛНЫЙ геном человека (то есть с некодирующими генами и последовательностями), фрагментированный или нет, дается в результате выравнивания человеческих чтений по человеческому эталону hg19.

Следующая таблица, выделенная оранжевым цветом, показывает результат, выраженный в «Av_cov = средний охват» выравнивания человеческих последовательностей из 3 лотов протестированного Priorix (1-го, 2-го и 3-го лота) на человеческих хромосомах. В столбце 1 chrM представляет собой митохондриальную ДНК, в то время как Chr1 до ChrY представляют собой собранные человеческие хромосомы, включая половые хромосомы X и Y. В столбце 2 сообщается длина собранных человеческих хромосом, выраженных в парах оснований.

Вакцинация письмо букчи стол

Охват является низким (Avg_cov в среднем по каждой хромосоме <1x), но однородность распределения считываний, которые однозначно совпадают по всем хромосомам человека, и наличие также считываний, которые соответствуют более высокому охвату генома митохондриальный (в клетках человека имеется 2 генома: ядерный размером около 3 гБн и разделенный на хромосомы и меньший круговой митохондриальный размером около 16 кбит / с), однако, позволяет однозначно распознать ситуацию, похожую на секвенирование генома нижних частот генома человека индивидуальны. Для более легкого понимания сказанного в части, обозначенной зеленым цветом, приведена последовательность низкочастотного полного генома человека (5 образцов, 4 женщины и 1 мужчина) на глубине, аналогичной той, которая была получена для 3 серий прививок Priorix Tetra.

Указание пола индивидуума (наиболее вероятно мужского пола) в вакцине также может быть выведено из соотношения между средним охватом для Х и Y хромосомы.

ДНК человека, содержащаяся в ранее секвенированных партиях Priorix, также была квалифицирована как принадлежащая к эмбриональной линии MRC-5, то есть к непрерывной клеточной линии из легочной ткани мужского абортивного плода 60-х годов, в котором вирус ветряная оспа и краснуха. Анализ вариантов митохондриальной ДНК, присутствующей в вакцине, по сравнению с митохондриальной ДНК линии MRC-5 (ДНК линии клеток была приобретена у ATCC, основного ресурса стандартных биологических материалов в мире) показывает, что они являются одним и тем же человеком.


Замечание 8

«Уже давно есть доказательства того, что даже очень высокие дозы человеческой ДНК не могут вызывать значительный риск даже в течение длительных периодов наблюдения, что подтверждается исследования нечеловеческих приматовиз клинического опыта с вакцинами и другими биологическими препаратами и из недавние исследования по оценке риска которые предполагают, что даже в тех неевропейских странах, где существуют пороговые значения для количества инъецируемой ДНК, эти пороговые значения являются излишне строгими ».

Ответ 8

Статья 1995 года (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104510568570036X?via%3Dihub), цитируемое вами, касается исследования на приматах, которое, на мой взгляд, явно недостаточно для демонстрации отсутствия инфекционности, онкогенности и аутоиммунитета человеческой ДНК, вводимой детям, как заявили те же авторы в заключительной части обсуждения. В эксперименте большое количество человеческой ДНК вводят обезьянам, поэтому не ДНК того же вида.

Вторая цитируемая статья (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23569076) очень четко заявляет, что остаточная ДНК является инфекционной при 2 микрограммах, даже если в любом случае этот предел получается из статистической оценки, а не из экспериментальных данных. В любом случае, следуя указаниям автора, вакцина «Приорикс» будет иметь количество ДНК плода, точно соответствующее количеству, определяемому как риск инфекционного заболевания.

Мерк для вакцины Varivax (ветряная оспа, живой аттенуированный вирус) заявляет в Американской листовке о наличии человеческой эмбриональной ДНК, полученной из клеток MRC-5, которая, согласно анализам, проведенным доктором Дайшером, составляет около 2 микрограммов.

Однако в случае итальянской листовки Priorix Tetra присутствие ДНК линии MRC-5 не указывается, несмотря на то, что она находится в количествах того же порядка, что и в американском Varivax. В любом случае 2 мкг эмбриональной ДНК MRC-5, на мой взгляд, не является остаточным количеством, а реальным компонентом вакцины.

Исследования доктора Дайшера in vitro, которые, как мы надеемся, будут опубликованы в ближайшее время, к сожалению, показывают удивительные результаты, когда вакцина, содержащая эмбриональную ДНК человека (гипометилированную), инкубируется in vitro с гемопоэтическими стволовыми клетками человека. Но мы ждем публикации исследования, а затем снова встретимся на эту тему.


Лоретта Болган *

* Доктор химии и фармацевтических технологий, доктор наук в области фармацевтики Гарвардской медицинской школы в Бостоне. Она работала в секторе фармацевтической промышленности, где занималась регистрацией и разработкой исследовательских проектов в области онкологии. Консультант по закону 210/92, загрязнение окружающей среды и профессиональные заболевания, участвовал в последней парламентской комиссии по расследованию по обедненному урану в группе вакцин. Нынешний консультант Национального ордена биологов по токсикологии лекарств и вакцин, он также занимается питанием и дополнительной терапией.


Скачать: CORVELVA-d.ssa-Лоретта-BOLGAN встречает а-Bucci.pdf