Краткое представление результатов

Сегодня мы представляем еще одно очень важное исследование геномного секвенирования клеточной линии, обнаруженной в четырехвалентной вакцине MPRV (корь, краснуха, эпидемический паротит и ветряная оспа) Priorix Tetra, и исследования линии клеток MRC-5 (которая, как заявлено, использовалась при разработке сама вакцина).

Подводя итоги предыдущих опубликованных отчетов: 

1. мы впервые продемонстрировали, как количество ДНК присутствует в вышеупомянутой вакцине был значительно выше разрешенного;  
2. Затем мы убедились, что клеточная линия собственно заявленный MRC-5; 
3. мы впоследствии приступили к секвенирование генома клеточной линии, выделенной непосредственно из вакциныподчеркивая очень тяжелые мутации, которые влекут за собой возможность серьезных рисков для здоровья при использовании этой вакцины.

То, что мы представляем здесь, - это как раз работа по сравнению двух геномов: что мы действительно нашли в вакцине и что из MRC-5, купленного в базе данных ATCC.

В результате две линии представляют важные различия с точки зрения генетической стабильности. В частности, геном вакцины, по-видимому, сильно модифицирован по сравнению с геномом линии клеток, депонированной в 1966 году.

Это означает, что производители, в данном случае Priorix tetra, приобрели клеточную линию в оптимальных условиях с точки зрения генетической стабильности и при непрерывном использовании с течением времени с целью производства, постепенно выпустили на рынок вакцины, содержащие генетический материал человека. Все чаще модифицируется и опасно для здоровья привитых. 

Поскольку регулирующие органы не требуют периодического контроля генетической стабильности линий плода и даже не устанавливают минимальный порог безопасности, мы можем сделать вывод, что фундаментальное требование к качеству и безопасности вакцин, которые были полученные из человеческих клеточных линий, то есть необходимость убедиться, что они не приобретают потенциально опасные мутации и перестройки, и гарантировать устранение остатков переработки генетического материала, если таковые имеются.

Мы не должны определять, какая часть процесса производства или консервации может повлиять на качество и безопасность продукта, но сегодня мы можем засвидетельствовать, опубликовав этот отчет, что контрольные органы должны срочно провести тщательное изучение результатов, выделенных в результате нашего анализа. в эти два года основное внимание уделялось готовому продукту, продаваемому и управляемому, а не только отдельным утвержденным «ингредиентам».

Помните еще раз, что эти продукты являются частью итальянского календаря вакцинации и в настоящее время в обязательном порядке назначаются педиатрическому населению нашей страны, а также других европейских стран и в целом во всем мире.

Контрольные органы несут огромную ответственность за безопасность, которая в настоящее время объявляется на словах, но на самом деле, по-видимому, и, как следует из нашего анализа, не может быть гарантирована и действительно явно игнорируется.

Круговая визуализация геномов (цирковой сюжет)

Графическое представление двух геномов, называемых «цирковой сюжет», показано ниже.

Значение различных концентрических кругов

1. Внешний круг (первый круг) - это номер хромосомы.
2. Второе кольцо (синее) представляет охват чтений в стиле гистограммы. Каждая гистограмма представляет собой среднее покрытие области 0,5 Мбит / с.
3. Третье кольцо (черное) представляет плотность INDEL в стиле «графика рассеяния». Каждая черная точка рассчитывается как количество INDEL (небольших вставок / удалений) в диапазоне 1 Мбит / с.
4. Четвертое кольцо (зеленое) представляет плотность snp в стиле «дисперсионный график». Каждая зеленая точка рассчитывается как количество SNP (вариантов одного нуклеотида) в диапазоне 1 Mbp.
5. Пятое кольцо представляет соотношение гомозиготности (оранжевый) и гетерозиготности (серый) SNP в стиле гистограммы. Каждая гистограмма рассчитывается из области 1 Мбит / с.
6. Шестое кольцо представляет собой вывод CNV (варианты в количестве копий). Красный означает получение кусков ДНК, а зеленый означает потерю.
7. Самое центральное кольцо представляет собой вывод SV (структурных вариантов) в экзонических и сплайсинговых областях. МЕЖДУ (оранжевый, транслокации), INS (зеленый, вставки), DEL (удаления, серый), DUP (дублирование, розовый) и INV (инверсия, синий).

выводы

Два генома показывают важные различия. В частности, геном вакцины оказывается сильно измененным по сравнению с геномом клеточной линии, депонированной в 1966 году. Надо сказать, что у нас не было возможности секвенировать клеточную линию, которая используется GlaxoSmithKline для производства вакцины Priorix Tetra, но как у стоковой оригинал. Фармацевтические компании, которые используют клеточные линии для производства лекарств и вакцин, имеют свою линию MRC-5, но это не меняет наших подозрений, то есть тот факт, что контроль генетической стабильности не требуется периодически, и это очень серьезно, по нашему мнению прежде всего потому, что он может присутствовать без ограничений.

Скачать: CORVELVA-сравнение-человеческого генома-Приорикс-Тетра-и-линии MRC-5.pdf

Сравнение генома человека, содержащегося в Priorix Tetra, и в клеточной линии MRC-5 (стандарт ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

Присутствие вируса краснухи было продемонстрировано секвенированием чрезвычайно глубокой библиотеки RNA-seq (было получено около 260 миллионов последовательностей Illumina). Было обнаружено 114 из 260 миллионов последовательностей, что составляет 0.00004% от общей последовательности. Последовательности генома краснухи были затем подтверждены вручную с помощью программного обеспечения BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Секвенированная библиотека на более низкой глубине (около 12 миллионов последовательностей, связанных с Illumina, что равно 6 миллионам секвенированных фрагментов библиотеки) не обнаружила присутствия ЛЮБЫХ чтений, относящихся к краснухе, в этой партии.

Последовательности других вирусов, присутствующих в вакцине (ветряная оспа, корь и эпидемический паротит), также были проверены таким же ручным способом, подтверждая, что они были правильно назначены.

Введение

Секвенсоры нового поколения стали инструментами выбора для углубленного анализа в области биологии и медицины, особенно точного. Эти инструменты позволяют использовать новый и более глобальный подход к ряду приложений, таких как секвенирование de novo, метагеномика, эпигеномика, секвенирование транскриптома и повторное секвенирование генома.

Это последнее применение (повторное секвенирование) широко распространено в человеческой области как в исследовательских, так и в диагностических целях и состоит в секвенировании с помощью технологии NGS (Next Generation Sequencing) всего индивидуального генома для картирования мутаций одиночного нуклеотида (SNP, произношение 'snip). '), вставки и делеции более или менее длинных последовательностей происходили в определенных положениях генома и вариации в количестве копий частей генома / генов (CNV, варианты числа копий).

Процедура секвенирования требует, чтобы ДНК человека была механически разбита на маленькие фрагменты (400-500 пар оснований) и фрагменты искусственных участков ДНК, называемых адаптерами, были привязаны к фрагментам, которые позволяют связывать фрагменты ДНК человека с стеклянная поверхность, на которой затем читаются основания (A, C, G, T). Основания ДНК читаются путем включения химических реакций нуклеотидов, меченных флуоресцентными молекулами. Миллионы последовательностей (считываний), полученных в результате секвенирования на поверхности стекла, затем сопоставляются с эталонным геномом человека с помощью соответствующего программного обеспечения, а затем идентифицируются все варианты, присутствующие в анализируемом геноме, по сравнению с эталоном.

Эта же процедура была выполнена для человеческого генома, присутствующего в партии Приорикс Тетра. п. A71CB256A и на ДНК, выделенной из линии клеток MRC-5, депонированной в 1966 году в ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC - ведущая в мире организация ресурсов и стандартов биологических материалов, миссия которой сосредоточена на приобретении, аутентификации, производстве, сохранении, разработке и распространении эталонных микроорганизмов, клеточных линий и других стандартных биологических материалов. Он был создан в 1925 году, когда комитет ученых признал необходимость централизованного сбора биологических материалов, которые могли бы служить ученым во всем мире.

Клеточная линия MRC-5 получена из нормальной ткани легкого мужского плода 14-недельного возраста и была депонирована в ATCC JP Jacobs в сентябре 1966 года. Эти клетки были объявлены способными удвоить от 42 до 46 популяций до начала. старения. Справочная статья для этой клеточной линии восходит к 1970 году: https://www.nature.com/articles/227168a0

Результаты

Как было показано ранее, ДНК человека присутствует в Priorix Tetra много. п. A71CB256A (обозначенный на следующих графиках как образец ID12051PT) представляет собой полный индивидуальный геном или геномную ДНК всех присутствующих хромосом мужчины. Графики охвата (средняя глубина = среднее покрытие) 22 хромосом человека и хромосом X и Y показаны ниже для вакцины (изображение выше) и клеточной линии MRC5 (изображение ниже).

Результаты анализа различных типов вариантов приведены ниже.

Варианты с одним нуклеотидом (SNP) и короткие вставки / делеции (InDels)

Варианты единичных оснований ДНК (SNP, произносится как «snip») представляют собой полиморфизмы, то есть вариации генетического материала, переносимого одним нуклеотидом. InDels, с другой стороны, представляют собой небольшие вставки и делеции длиной менее 50 п.н. и представляют собой другой класс геномных вариантов в геноме человека.

SNP (однонуклеотидные варианты) - ID12051PT

SNP (однонуклеотидные варианты) - MRC-5

INDELs (небольшие вставки / удаления) - ID12051PT

INDELs (небольшие вставки / удаления) - MRC-5 

CNV (варианты количества копий) и SV (структурные варианты)

Варианты в количестве копий (CNV) являются геномными вариантами из-за различий в количестве копий относительно больших фрагментов (более 50 п.н.) между отдельными геномами. Существует два типа CNV: тип «усиление» (усиление копирования) и тип «потеря» (потеря копий).

Структурные варианты (SV) - это варианты генома с относительно большим размером (> 50 п.н.), включая делеции, дупликации, инсерции, инверсии и транслокации.

CNV (вариации количества копий)

SV (структурные варианты)

Круговая визуализация геномов (цирковой сюжет)

Графическое представление двух геномов, называемых «цирковой сюжет», показано ниже.

Значение различных концентрических кругов

1. Внешний круг (первый круг) - это номер хромосомы.
2. Второе кольцо (синее) представляет охват чтений в стиле гистограммы. Каждая гистограмма представляет собой среднее покрытие области 0,5 Мбит / с.
3. Третье кольцо (черное) представляет плотность INDEL в стиле «графика рассеяния». Каждая черная точка рассчитывается как количество INDEL (небольших вставок / удалений) в диапазоне 1 Мбит / с.
4. Четвертое кольцо (зеленое) представляет плотность snp в стиле «дисперсионный график». Каждая зеленая точка рассчитывается как количество SNP (вариантов одного нуклеотида) в диапазоне 1 Mbp.
5. Пятое кольцо представляет соотношение гомозиготности (оранжевый) и гетерозиготности (серый) SNP в стиле гистограммы. Каждая гистограмма рассчитывается из области 1 Мбит / с.
6. Шестое кольцо представляет собой вывод CNV (варианты в количестве копий). Красный означает получение кусков ДНК, а зеленый означает потерю.
7. Самое центральное кольцо представляет собой вывод SV (структурных вариантов) в экзонических и сплайсинговых областях. МЕЖДУ (оранжевый, транслокации), INS (зеленый, вставки), DEL (удаления, серый), DUP (дублирование, розовый) и INV (инверсия, синий).

выводы

Два генома показывают важные различия. В частности, геном вакцины оказывается сильно измененным по сравнению с геномом клеточной линии, депонированной в 1966 году. Надо сказать, что у нас не было возможности секвенировать клеточную линию, которая используется GlaxoSmithKline для производства вакцины Priorix Tetra, но как у стоковой оригинал. Фармацевтические компании, которые используют клеточные линии для производства лекарств и вакцин, имеют свою линию MRC-5, но это не меняет наших подозрений, то есть тот факт, что контроль генетической стабильности не требуется периодически, и это очень серьезно, по нашему мнению прежде всего потому, что он может присутствовать без ограничений.