Мы наконец-то пришли, спустя почти два года вышла первая публикация, посвященная рецензированию наших анализов, и последуют многие другие.

Здесь мы попытаемся кратко и нетехническим образом подытожить на этих первых страницах: что было опубликовано, как оно действует и почему оно важно для нашего исследования вакцин. 

(С другой стороны, страницы с 3 по XNUMX посвящены техническому исследованию, оставляя оценку самой статьи тем, кто работает в этом секторе)

Что опубликовано на "F1000 Research" ¹ это результат начальной части работы, выполненной от имени Ассоциации Корвельва одной из лабораторий, отвечающих за анализы. Напомним, - поскольку с начала этой работы прошло более двух лет, а к первоначальным добавлено много других результатов, - что Первой серьезной проблемой, которую нам пришлось исследовать, было ненормальное количество человеческой ДНК, обнаруженное в проанализированных вакцинах. 

В обеих проанализированных четырехвалентных вакцинах MPRV первоначально было обнаружено количество от 1 до 2,7 мкг / флакон (в соответствии с рассматриваемой публикацией), и это привело нас к публичному и немедленному сообщению об этом результате, поскольку просто не ожидалось, что это количество ДНК присутствовало в вакцине.

Помимо соображений и выводов, к которым приходит работа, которые носят чисто технический характер и поэтому понятны только тем, кто занимается исследованиями в области метагеномики, на графиках видно, что в двух образцах вакцин содержится высокий процент чтения ДНК человека в дополнение к тем, которые ожидаются от генома вируса ветряной оспы (вирус альфа-герпеса человека 3), обнаруживается только из четырех, как анализ ДНК-seq был представлен в статье.
Тем не менее, мы хотели бы подчеркнуть, что позднее количество ДНК, найденное и подтвержденное с тем же метод, который сейчас подтвержден здесь были даже выше: до 3,7 микрограмма на флакон, что привело к значительной разнице между партиями и партиями.
Фактически в нашем отчете раскрыто 22.12.2018 ² результаты были сообщены для дальнейшие лоты проанализированы после обсужденных в статьезатем подтверждено межлабораторным анализом, который все еще публикуется. 

Поэтому, что нас больше всего интересует в этой публикации, так это то, что она проверяет используемый методставит важный вопрос о дискуссиях о «типе» проведенных анализов и, следовательно, решительно подтверждает всю работу, проделанную впоследствии методом NGS: понимание типа содержащегося генетического материала, наличия случайных вирусов, значительного отсутствия аттенуированных вирусов, которые вместо этого должны присутствовать, и количества вместо этого неконтролируемого (также потому, что оно сильно отличается от образца к образцу) присутствующей ДНК человека, мутантной популяции , фаги, ДНК других видов и постепенно все результаты, которые вы найдете, обобщены на нашем сайте. ³

Все, что с точки зрения биологического содержания, которое мы осуждали в последние годы, рабски сообщая результаты контрольным органам, приобретает более актуальную научную коннотацию (даже если, повторим еще раз, волноваться пришлось не из-за экспертных оценок. но представленные данные очень серьезны по своему содержанию и возможному значению для здоровья человека). Однако теперь, когда публикация метода завершена, мы потребуем получить ответы, которые еще не пришли.

Эти результаты убедительно подтверждают присутствие эмбриональной ДНК в вакцинах Priorix tetra в количествах, варьирующихся между различными партиями, что указывает на плохой контроль качества этих фармацевтических продуктов. 

Мы также помним отчет о секвенировании всего генома MRC-5, опубликованный на веб-сайте Corvelva 27.09.2019 ⁴ в которой глубокая модификация этой ДНК проявляется также в генах, связанных с развитием опухолевых патологий (другие данные публикуются).

Загрязняющая ДНК плода, присутствующая во всех анализируемых образцах в различных количествах (следовательно, неконтролируемых), в 300 раз превышает предел, установленный EMA для канцерогенной ДНК (10 нг / доза, что соответствует ДНК, содержащейся примерно в 1000 раковых клетках, получены на основе статистического расчета, в то время как предел предосторожности составляет 100 пг / доза), который должен обязательно применяться также к ДНК плода, которая неизбежно загрязняет Priorix Tetra.

Отсюда следует, что эту вакцину следует считать дефектной и потенциально опасной для здоровья человека, в частности педиатрической популяции, гораздо более уязвимой для генетического и аутоиммунного повреждения из-за незрелости систем укрытия.

Как и ожидалось, следующее является более «техническим» и трудным для понимания непрофессионалами, поэтому мы решили, также для прозрачности, приложить к этому документу также «EMA - NGS Dossier Обсуждение результатов, полученных в результате исследования качества вакцин», Мы только должны были экстраполировать раскрытую часть, более 50 страниц файлов по сравнению с 200 NGS, так как большая часть информации, содержащейся и зарегистрированной в регулирующих органах, должна оставаться конфиденциальной. Суровый закон науки требует, чтобы данные публиковались в журнале только в том случае, если они не опубликованы, а мы, имея в наличии несколько других публикаций, не хотим подвергать их риску.

 Наконец, чтобы избежать недоразумений, мы хотим упомянуть из публикации часть «Декларации о финансировании»: 

«Метагеномное секвенирование B1 и B2 финансировалось Corvelva (некоммерческая ассоциация, Veneto, Италия) в рамках контракта на обслуживание с лабораторией. Никаких других вкладов в поддержку работы не было. Спонсоры не играли никакой роли в планировании исследования, в сборе и анализе данных, в решении опубликовать или в подготовке рукописи ».

---

Вложения:

• Публикация - Ты меня понимаешь? Влияние снижения покрытия на исследования последовательности метагеномного дробовика
• CORVELVA-нить-NGS-ЭМА-ит
• PDF - Первая рецензируемая публикация о вакцинах MPRV (Priorix Tetra)

В статье «Ты меня укрываешь? Влияние снижения покрытия на исследования последовательности метагеномного дробовика »

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

Авторы решают технико-методологический вопрос о том, можно ли использовать массовый параллельный метагеномический подход с низким охватом чтения для характеристики сложных биологических матриц. Рассчитываются оценки разнообразия и численности видов и оценивается способность реконструировать метагеном de novo с точки зрения длины и полноты, чтобы понять, насколько уменьшение глубины секвенирования, варьируемое путем случайной подвыборки результатов секвенирования, может Результаты показывают, что индексы разнообразия сообществ прокариот, эукариот и вирусов могут быть точно оценены с помощью 500.000 1.000.000 считываний или меньше, хотя для особо сложных образцов может потребоваться 1.000.000 XNUMX XNUMX считываний. Напротив, проект по реконструкции метагенома и содержащихся в нем генов требует более XNUMX чтений.

Среди различных и очень разных сложных матриц, подвергнутых массированному метагеномному анализу, были включены два биологических препарата, то есть две разные партии живой ослабленной вакцины MPRV, используемой для иммунизации против кори, эпидемического паротита, краснухи и ветряной оспы у детей. ДНК извлекали из вакцин, затем создавали геномные библиотеки с использованием стандартных коммерческих протоколов и проводили массовое секвенирование по технологии Illumina.

Помимо соображений и выводов, к которым приходит работа, которые носят чисто технический характер и поэтому понятны только тем, кто проводит исследования в области метагеномики, то, что наблюдается в круговых диаграммах, содержащихся в «Расширенных данных» (https://osf.io/wq395/ образцы B1 и B2) заключается в том, что два образца вакцины, как было установлено, содержат высокий процент считываний ДНК человека в дополнение к тем, которые ожидаются от генома вируса ветряной оспы (вирус альфа-герпеса человека 3), единственного обнаруживаемого из четырех, указанных в статье был представлен анализ ДНК-секвенирования. 

71% показаний в одной партии и 88% в другой - человеческого происхождения, предположительно происходящих из линии клеток эмбрионального происхождения MRC-5 (помните, что последующие анализы подтвердили, что линия MRC5) в котором живые аттенуированные вирусы краснухи и ветряной оспы выращиваются во время приготовления вакцины. Кроме того, как это было в разных партиях одной и той же вакцины MPRV, протестированной Corvelva в период между 2017 и 2019 годами, количество выделенной ДНК составляет порядка микрограмма. 

В партиях вакцин, протестированных с использованием тех же протоколов и технологий, о которых сообщалось в материалах и методах статьи, обнаруженные количества варьировались от 1 до почти 3 микрограммов на флакон, количества варьировались от одной партии к другой, но всегда были значительными

B1 https://osf.io/86mbn/

B2 https://osf.io/dxayz/

В отчете, раскрытом Corvelva от 22.12.2018, были представлены следующие результаты для дальнейшие лоты проанализированы после обсужденных в статье, затем дополнительно подтверждается межлабораторным анализом, который все еще публикуется: 

Приорикс тетра много. A71CB205A (июнь 2018 г.) - анализ ДНК

Приорикс тетра много. A71CB256A (декабрь 2018 г.) - анализ ДНК

Анализ ДНК

Измерение концентрации ДНК с флуориметром QuBit показал, что партия A71CB205A содержит количество 1.7 мкг рДНК общее количество на 0.5 мл дозы, рассчитанное следующим образом: 9.41 нг / мкл (концентрация, определенная в QuBit) x 45 (конечный объем ресуспендирования ДНК после экстракции, выраженный в микролитрах) x 4 (начальный объем, подвергнутый процедуре экстракции, составляет ¼ объем дозы, содержащейся во всем флаконе, равен 0.5 мл).

Измерение концентрации ДНК с флуориметром QuBit показал, что партия A71CB256A содержит количество гДНК всего 3.7 мкг на дозу 0.5 млрассчитывается следующим образом: 40.8 нг / мкл (концентрация определяется в QuBit) x 55 (конечный объем ресуспендирования ДНК после экстракции, выраженный в микролитрах) x 5/3 (начальный объем, подвергнутый процедуре экстракции, составляет 300 мкл из 500 мкл суспензии).

ДНК человека, найденная в этой партии, имеет относительное соотношение около 8 к 1 по сравнению с ДНК ветряной оспы (см. Следующие результаты классификации фрагментов DNA-seq, в которых выясняется, что 88% от общего количества секвенированных фрагментов ДНК составляет человеческого происхождения, и 11% имеют геном вируса ветряной оспы). Учитывая, что NGS является количественной технологией, флуориметрическое количественное определение всей ДНК, выделенной из вакцины (например, партия. A71CB256A = 3,7 микрограмма на дозу), связанное с рассмотрением относительного количественного определения, сделанного выше (8: 1), позволяет нам сказать, что человеческая ДНК может быть вокруг 2,9 микрограмма на дозупо сравнению с примерно 740 нанограммами ДНК ветряной оспы. Также возможно, что по меньшей мере, часть ДНК с высокой молекулярной массой, которая видна на геле, может представлять собой ДНК человека с высокой молекулярной массой.

Анализ РНК

La quantità di РНК содержится во флаконе с вакциной партии A71CB256A примерно 200ng.

Значение RIN, равное 8, означает РНК превосходного качества и интактную эукариотическую РНК, поскольку присутствуют пики 18S и 28S, типичные для эукариотической РНК.

Ответы на наши вопросы, которые со временем будут направлены в регулирующие органы, имеют большое значение. В настоящее время агентства еще не ответили на вопросы относительно результатов полного анализа, предоставленного EMA и AIFA.

Выдержка из ответа EMA на наш вопрос относительно безопасности остатков mrc-5 в априорной тетра-вакцине (ссылка на запрос EMA ask-43967 3 августа 2018 г.) - «На основании опубликованной информации Priorix Tetra содержит вирусные штаммы, полученные отдельно в клетках куриного эмбриона (свинка и корь) или в диплоидных клетках человека MRC-5 (краснуха и ветряная оспа). Клеточные линии, используемые для Priorix Tetra, включают человеческие диплоидные клеточные линии, которые не могут непрерывно делиться. Отметим, что, согласно Европейской Фармакопее, диплоидные клеточные линии MRC-5 не являются онкогенными, что продемонстрировано десятилетиями использования и контроля, и поэтому максимальный предел для ДНК клеток MRC-5 не применяется ».

До настоящего времени не было предоставлено никаких доказательств (ни в отношении сертификатов анализа качества продукта, ни в научной справочной литературе по EMA) этих средств контроля, которые гарантируют, что целесообразно не применять максимальный предел.

В руководстве FDA «Руководство для промышленности: характеристика и квалификация клеточных субстратов и других биологических материалов, используемых при производстве вирусных вакцин для индикации инфекционных заболеваний» ⁶ сообщается, что:

• Штамм диплоидных клеток всегда должен оставаться диплоидным. Если эти характеристики не являются стабильными, необходимо продемонстрировать, что нестабильность не оказывает негативного влияния на производство или соответствие продукта.
• для широко используемых штаммов диплоидных клеток человека, таких как клетки MRC-5 и WI-38, измерение остаточной ДНК может не потребоваться, поскольку мы не считаем остаточную ДНК этих диплоидных клеток человека проблемой безопасности  
• Остаточная ДНК должна быть ограничена для неонкогенных непрерывных клеток, таких как клетки VERO нижних частот, менее 10 нг / доза для парентеральной инокуляции, как рекомендовано ВОЗ

А в руководстве ВОЗ «Приложение 3 - Рекомендации по оценке клеточных культур животных в качестве субстратов для производства биологических препаратов и для характеристики банков клеток. Замена Приложения 1 серии технических докладов ВОЗ, n. 878 " ⁷ добавим: (...) с 38-х годов накоплен значительный опыт в цитогенетике WI-5 и MRC-60

и чтобы поддержать этот опыт, перечислены следующие статьи:

• Джейкобс Дж.П. Обновлены результаты по кариологии клеточных штаммов WI-38, MRC-5 и MRC-9. Разработки в области биологической стандартизации, 1976, 37: 155–156.
• Джейкобс Дж.П. и др. Руководство по приемлемости, управлению и тестированию серийно размножающихся диплоидных клеток человека для производства живых вирусных вакцин для применения у человека. Журнал биологической стандартизации, 1981, 9: 331–342.
• Petricciani JC et al. Стандарты кариологии для линии резус-диплоидных клеток DBS-FRhL-2. Журнал биологической стандартизации, 1976, 4: 43–49.
• Schollmayer et al. Анализ с высоким разрешением и дифференциальная конденсация в хромосомах человека с RBA-полосами. Human Genetics, 1981, 59: 187–193.
• Rønne M. Хромосомная подготовка и методы полосного разрешения высокого разрешения: обзор. Журнал молочной науки, 1989, 72: 1363–1377.

Можно ясно видеть, что справочная литература, подтверждающая, что диплоидные клетки, используемые для производства вакцин, безопасны с точки зрения генетической стабильности, это устарело, Уже 40 лет назад были обнаружены первые генетические аномалии, считающиеся незначительными с точки зрения безопасности вакцин, и того, о чем сообщалось в руководящих принципах ВОЗ, с тех пор не было сделано никаких обновлений с новыми технологиями секвенирования, в частности в NGS, который, кроме того, является экономическим и быстрый, с последствием того, что в вакцинах вводят на протяжении десятилетий агентства допускали присутствие все более и более генетически модифицированных ДНК в неконтролируемых количествах. В этой связи см. Отчет о секвенировании всего генома MRC-5, опубликованный на веб-сайте Corvelva 27.09.2019. ⁸ в которой глубокая модификация этой ДНК проявляется также в генах, связанных с развитием опухолевых патологий. (данные публикуются)

Сообщается отрывок из письма доктора Т. Дейшера, мирового эксперта по использованию стволовых клеток в терапевтических целях и генной терапии, что подчеркивает озабоченность рисками, связанными с использованием вакцин, загрязненных остатками человеческих эмбриональных клеток: 

Доктор Т. ДАЙШЕР (письмо правителям - 8 апреля 2019 г.) ⁹ - (...) инъекция нашим детям зараженного ДНК плода человека несет в себе риск возникновения двух хорошо известных заболеваний:

• инсерционный мутагенез: человеческая эмбриональная ДНК включена в ДНК ребенка, вызывая мутации. Генная терапия с использованием гомологичной рекомбинации небольших фрагментов показала, что такие небольшие количества, как 1,9 нг / мл фрагментов ДНК, приводят к встраиванию в геном стволовых клеток у 100% инъецированных мышей. Уровни фрагментов ДНК плода человека у наших детей после вакцинации вакцинами MMR, VARIVAX (ветряная оспа) или гепатита A достигают уровня выше 1,9 нг / мл.
• аутоиммунное заболевание: ДНК плода человека стимулирует реакцию иммунной системы на атаку организма ребенка.

Наши результаты значительно усиливают экспериментальные наблюдения доктора Дейшера и, прежде всего, тот факт, что контаминирующая ДНК плода, присутствующая во всех проанализированных образцах в переменных (поэтому неконтролируемых) количествах, является до 300 раз превышает предел EMA для канцерогенной ДНК (10 нг / доза, соответствующая ДНК, содержащейся примерно в 1000 раковых клетках, полученная на основе статистического расчета, в то время как предел предосторожности составляет 100 пг / доза) предел, который также должен обязательно применяться к ДНК плода, которая неизбежно загрязняет Priorix Tetra.

Отсюда следует, что эту вакцину следует считать дефектной и потенциально опасной для здоровья человека, в частности педиатрической популяции, гораздо более уязвимой для генетического и аутоиммунного повреждения из-за незрелости систем укрытия.

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/
2. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
3. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate.html
   https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate-en.html
4. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
5. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
6. https://www.federalregister.gov/documents/2010/03/04/2010-4553/guidance-for-industry-characterization-and-qualification-of-cell-substrates-and-other-biological
7. https://www.who.int/biologicals/vaccines/TRS_978_Annex_3.pdf
8. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
9. https://www.corvelva.it/approfondimenti/notizie/mondo/lettera-aperta-ai-legislatori-sul-dna-fetale-nei-vaccini-theresa-deisher.html