Primera publicación de revisión por pares sobre vacunas MPRV (Priorix Tetra)

Primera publicación de revisión por pares sobre vacunas MPRV (Priorix Tetra)

Finalmente estamos allí, después de casi dos años sale la primera publicación en revisión por pares de nuestros análisis y muchos otros seguirán.

Aquí intentamos resumir en estas primeras páginas, de una manera muy discursiva y no técnica: qué se ha publicado, qué validez tiene y por qué es importante para nuestra investigación de vacunas.

(Por otro lado, las páginas 3 a XNUMX están dedicadas a un estudio técnico, dejando la evaluación del artículo en sí a quienes trabajan en el sector)

Lo publicado en "F1000 Research" 1 Es el resultado de la parte inicial del trabajo realizado en nombre de la Asociación Corvelva por uno de los laboratorios a cargo de los análisis. Recuerde, porque han pasado más de dos años desde el comienzo de este trabajo y se han agregado muchos otros resultados a los iniciales, que el El primer problema importante que tuvimos que investigar fue la cantidad anormal de ADN humano que se encuentra en las vacunas analizadas.

En ambas vacunas cuadrivalentes de MPRV analizadas, inicialmente se encontraron cantidades de 1 a 2,7 microgramos / vial (según la publicación en cuestión), y esto nos llevó a informar pública e inmediatamente este resultado porque, simplemente, no se esperaba que Esta cantidad de ADN estaba presente en una vacuna.

Además de las consideraciones y conclusiones a las que llega el trabajo, que son estrictamente técnicas y, por lo tanto, comprensibles solo para aquellos que realizan investigaciones en el campo de la metagenómica, lo que se observa en los gráficos es que se encontró que las dos muestras de vacuna contienen un alto porcentaje de lecturas de ADN humano además de las esperadas del genoma del virus de la varicela (virus alfaherpes humano 3), solo detectable de los cuatro, como un análisis de ADN-seq se presentó en el artículo.
Sin embargo, nos gustaría enfatizar que más tarde las cantidades de ADN encontradas y confirmadas con el mismo método que ahora está validado aquí fueron incluso mayores: hasta 3,7 microgramos por vial, lo que condujo a una diferencia significativa entre lote y lote.
De hecho, en nuestro informe divulgado el 22.12.2018 2 los resultados han sido reportados para lotes adicionales analizados después de los discutidos en el artículo, luego confirmado por análisis interlaboratorios que aún se están publicando.

Por lo tanto, lo que más nos interesa de esta publicación es que valida el método utilizado, pone un punto importante en las discusiones sobre el "tipo" de análisis realizados y, en consecuencia confirma decisivamente todo el trabajo realizado posteriormente con el método NGS: los conocimientos sobre el tipo de material genético contenido, la presencia de virus adventicios, la gran ausencia de virus atenuados que deberían estar presentes y la cantidad fuera de control (también porque es muy diferente de una muestra a otra) del ADN humano presente, la población mutante , fagos, ADN de otras especies, y gradualmente todos los resultados que encuentre resumidos en nuestro sitio. 3

Todo lo que, desde el punto de vista del contenido biológico, hemos denunciado en los últimos años, al informar los resultados a los organismos de control, adquiere una connotación científica más relevante (incluso si, repetimos nuevamente, no fueron las revisiones por pares las que tuvieron que preocuparse pero los datos presentados, muy serios en su contenido y en sus posibles implicaciones para la salud humana). Sin embargo, ahora que se ha realizado la publicación del método, exigiremos obtener las respuestas que aún no han llegado.

Estos resultados confirman de manera concluyente la presencia de ADN fetal en las vacunas tetra Priorix, en cantidades que varían entre los distintos lotes, lo que indica un control de baja calidad de estos productos farmacéuticos.

También recordamos el informe sobre la secuenciación de todo el genoma MRC-5 publicado en el sitio web de Corvelva el 27.09.2019 4 en el cual la profunda modificación de este ADN es evidente también en genes asociados con el desarrollo de patologías tumorales (se están publicando otros datos).

El ADN fetal contaminante presente en todas las muestras analizadas en cantidades variables (por lo tanto, no controladas) es hasta 300 veces mayor que el límite establecido por la EMA para el ADN cancerígeno (10 ng / dosis, correspondiente al ADN contenido en aproximadamente 1000 células cancerosas, obtenido sobre la base de un cálculo estadístico, mientras que el límite de precaución es de 100 pg / dosis), que necesariamente debe aplicarse también al ADN fetal que inevitablemente contamina el Priorix Tetra.

Se deduce que esta vacuna debe considerarse defectuosa y potencialmente peligrosa para la salud humana, en particular en la población pediátrica mucho más vulnerable al daño genético y autoinmune debido a la inmadurez en los sistemas de refugio.

Como se anticipó, lo siguiente es más "técnico" y difícil de entender para los no profesionales, por lo tanto, hemos decidido, también por transparencia, adjuntar a este documento también "EMA - NGS Dossier Discusión de los resultados obtenidos de la encuesta de calidad de la vacuna". Solo tuvimos que extrapolar la parte divulgada, más de 50 páginas de expedientes en comparación con las 200 del NGS, ya que gran parte de la información contenida y registrada en los organismos reguladores debe permanecer confidencial. La severa ley de la ciencia requiere que los datos se publiquen en una revista solo si no se publican y nosotros, al tener varias otras publicaciones en progreso, no queremos ponerlos en riesgo.

Finalmente, para evitar cualquier malentendido, queremos mencionar, de la publicación, la parte de la "Declaración de financiación":

“La secuencia metagenómica B1 y B2 fue financiada por Corvelva (asociación sin fines de lucro, Veneto, Italia), como parte de un contrato de servicio con el laboratorio. Ninguna otra contribución estuvo involucrada en apoyar el trabajo. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, en la recopilación y análisis de los datos, en la decisión de publicar o en la preparación del manuscrito ".

Adjuntos:


En el artículo "¿Me covinas? Efecto de la reducción de la cobertura en los estudios de secuenciación de escopetas metagenoma "

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

Los autores abordan la cuestión técnico-metodológica de si es posible utilizar un enfoque metagenómico paralelo con baja cobertura de lecturas, para caracterizar matrices biológicas complejas. Se calculan las estimaciones de diversidad, abundancia de especies y se evalúa la capacidad de reconstruir el metagenoma de novo en términos de longitud e integridad, con el fin de comprender cuánto puede disminuir la profundidad de secuencia, variada por submuestreo aleatorio de lecturas de secuencia. Los resultados muestran que los índices de diversidad de comunidades procariotas, eucariotas y virales complejas pueden estimarse con precisión con 500.000 lecturas o menos, aunque las muestras particularmente complejas pueden requerir 1.000.000 de lecturas. Por el contrario, un proyecto que involucra la reconstrucción del metagenoma y los genes contenidos en él, requiere un mayor número de 1.000.000 de lecturas.

Entre las diversas y muy diferentes matrices complejas sometidas a un análisis metagenómico masivo, se han incluido dos medicamentos biológicos, es decir, dos lotes diferentes de vacunas vivas atenuadas contra el MPRV que se usan para la inmunización contra el sarampión, las paperas, la rubéola y la varicela en niños. Se extrajo el ADN de las vacunas, luego se construyeron bibliotecas genómicas utilizando protocolos comerciales estándar y se llevó a cabo una secuenciación masiva con la tecnología Illumina.

Además de las consideraciones y conclusiones a las que llega el trabajo, que son estrictamente técnicas y, por lo tanto, comprensibles solo para aquellos que realizan investigaciones en el campo de la metagenómica, lo que se observa en los gráficos circulares contenidos en los 'Datos extendidos' (https://osf.io/wq395/ muestras B1 y B2) es que se encontró que las dos muestras de vacuna contenían un alto porcentaje de lecturas de ADN humano además de las esperadas del genoma del virus de la varicela (virus alfaherpes humano 3), el único detectable de los cuatro, que se encuentra en el artículo Se presentó un análisis de secuencia de ADN.

El 71% de las lecturas en un lote y el 88% en el otro son de origen humano, presumiblemente derivadas de la línea celular de origen fetal MRC-5 (recuerde que los análisis posteriores han confirmado que la línea es MRC5) en el que se cultivan virus de la rubéola y la varicela atenuados vivos durante la preparación de la vacuna. Además, como sucedió en los diferentes lotes de la misma vacuna MPRV probada por Corvelva entre 2017 y 2019, la cantidad de ADN extraído es del orden del microgramo.

En los lotes de vacunas probados con los mismos protocolos y tecnología reportados en los materiales y métodos del artículo, las cantidades detectadas variaron entre 1 y casi 3 microgramos por vial, cantidades que varían entre un lote y otro, pero siempre significativas

corvelva mprv1

B1 https://osf.io/86mbn/

corvelva mprv1

B2 https://osf.io/dxayz/

En el informe divulgado por Corvelva el 22.12.2018, se informaron los siguientes resultados para lotes adicionales analizados después de los discutidos en el artículo, luego confirmado por el análisis interlaboratorio que aún se publica:

Priorix Tetra lot. A71CB205A (junio de 2018) - Análisis de ADN

corvelva mprv3

Priorix Tetra lot. A71CB256A (diciembre de 2018) - Análisis de ADN

corvelva mprv3

Análisis de ADN

La medida de la concentración de ADN con el fluorímetro QuBit mostró que el lote A71CB205A contiene una cantidad de 1.7 µg de ADNg totales por dosis de 0.5 ml, calculados de la siguiente manera: 9.41 ng / µl (concentración determinada en QuBit) x 45 (volumen de resuspensión final de ADN después de la extracción, expresado en microlitros) x 4 (el volumen inicial sometido al procedimiento de extracción es ¼ el volumen de la dosis contenida en todo el vial igual a 0.5 ml).

La medida de la concentración de ADN con el fluorímetro QuBit mostró que el lote A71CB256A contiene una cantidad de ADNg de 3.7 µg en total por dosis de 0.5 ml, calculado de la siguiente manera: 40.8 ng / µl (concentración determinada en QuBit) x 55 (volumen de resuspensión final de ADN después de la extracción expresada en microlitros) x 5/3 (el volumen inicial sometido al procedimiento de extracción es 300 µl de 500 µl de suspensión).

El ADN humano que se encuentra en este lote es aproximadamente de 8 a 1 en relación con el ADN de la varicela (véanse los siguientes resultados de la clasificación de los fragmentos de ADN-seq, en los que se deduce que el 88% del total de los fragmentos de ADN secuenciados es de origen humano, y el 11% son del genoma del virus de la varicela). Teniendo en cuenta que el NGS es una tecnología cuantitativa, la cuantificación fluorimétrica del ADN total extraído de la vacuna (por ejemplo, lote. A71CB256A = 3,7 microgramos por dosis), asociado con la consideración de la cuantificación relativa realizada anteriormente (8: 1), nos permite decir que el ADN humano podría estar presente 2,9 microgramos por dosis, en comparación con aproximadamente 740 nanogramos de ADN de varicela. También es plausible que al menos una porción del ADN de alto peso molecular que se ve en el gel puede ser ADN humano de alto peso molecular.

Análisis de ARN

La quantità di ARN contenido en el vial del lote de vacuna A71CB256A se encontró que era aproximadamente 200ng.

El RIN igual a 8 indica un ARN de excelente calidad y un ARN eucariota intacto, ya que están presentes los picos 18S y 28S típicos del ARN eucariota.

De gran importancia son las respuestas a nuestras preguntas enviadas a las agencias reguladoras a lo largo del tiempo. En la actualidad, las agencias aún no han respondido las preguntas sobre los resultados de los análisis completos entregados a EMA y AIFA.

Extracto de la respuesta de EMA a nuestra pregunta sobre la seguridad de los residuos de mrc-5 en la tetravacuna priorix (solicitud de referencia de EMA ask-43967 3 de agosto de 2018) - “Según la información publicada, Priorix Tetra contiene cepas virales producidas por separado en células embrionarias de pollo (paperas y sarampión) o en células diploides humanas MRC-5 (rubéola y varicela). Las líneas celulares utilizadas para Priorix Tetra incluyen líneas celulares diploides humanas que no pueden dividirse continuamente. Tenga en cuenta que, según la Farmacopea Europea, las líneas celulares diploides MRC-5 no son tumorigénicas, como lo demuestran décadas de uso y control, y por lo tanto no se aplica un límite máximo para el ADN de las células MRC-5 "

Hasta la fecha, no se han proporcionado pruebas (ni en términos de certificados de análisis sobre la calidad del producto, ni de literatura de referencia científica para la EMA) de estos controles que garanticen que sea apropiado no aplicar un límite máximo.

En la directriz de la FDA "Orientación para la industria: caracterización y calificación de sustratos celulares y otros materiales biológicos utilizados en la producción de vacunas virales para indicaciones de enfermedades infecciosas" 6 se informa que:

  • una cepa de células diploides siempre debe permanecer diploide. Si estas características no son estables, es necesario demostrar que la inestabilidad no afecta negativamente la producción o la conformidad del producto.
  • para las cepas de células diploides humanas ampliamente utilizadas, como las células MRC-5 y WI-38, la medición del ADN residual puede no ser necesaria porque no consideramos que el ADN residual de estas células diploides humanas sea un problema de seguridad
  • el ADN residual debe limitarse para las células continuas no tumorigénicas, como las células VERO de paso bajo, menos de 10 ng / dosis para la inoculación parenteral según lo recomendado por la OMS

Y en la directriz de la OMS “Anexo 3 - Recomendaciones para la evaluación de cultivos de células animales como sustratos para la fabricación de medicamentos biológicos y para la caracterización de bancos de células. Reemplazo del Anexo 1 de la serie de informes técnicos de la OMS, n. 878 " 7 agregamos: (...) se ha acumulado una experiencia considerable en la citogenética de WI-38 y MRC-5 desde la década de 60

y para respaldar esta experiencia, se enumeran los siguientes artículos:

  • Jacobs JP. Resultados actualizados sobre la cariología de las cepas celulares WI-38, MRC-5 y MRC-9. Desarrollos en la estandarización biológica, 1976, 37: 155-156.
  • Jacobs JP. et al. Directrices para la aceptabilidad, gestión y pruebas de células diploides humanas propagadas en serie para la producción de vacunas de virus vivos para su uso en el hombre. Journal of Biological Standardization, 1981, 9: 331–342.
  • Petricciani JC y col. Estándares de cariología para la línea celular diploide rhesus DBS-FRhL-2. Journal of Biological Standardization, 1976, 4: 43-49.
  • Schollmayer y col. Análisis de alta resolución y condensación diferencial en cromosomas humanos con banda RBA. Human Genetics, 1981, 59: 187–193.
  • Rønne M. Preparación de cromosomas y técnicas de bandas de alta resolución: una revisión. Journal of Dairy Science, 1989, 72: 1363–1377.

Se puede observar claramente que la literatura de referencia, para mantener que las células diploides utilizadas para la producción de vacunas son seguras desde el punto de vista de la estabilidad genética, es obsoleto. Ya hace 40 años se encontraron las primeras anomalías genéticas, consideradas insignificantes para la seguridad de las vacunas, y según lo informado en la directriz de la OMS, desde entonces no se han realizado actualizaciones con las nuevas tecnologías de secuenciación, en particular en NGS, que es además económica y rápido, con la consecuencia de que en las vacunas administradas Durante décadas, las agencias han permitido la presencia de ADN modificado genéticamente cada vez más progresivamente en cantidades incontroladas. A este respecto, vea el informe sobre la secuenciación de todo el genoma MRC-5 publicado en el sitio web de Corvelva el 27.09.2019. 8 en el cual la profunda modificación de este ADN es evidente también en genes asociados con el desarrollo de patologías tumorales. (datos que se publican)

Se informa un extracto de la carta del Dr. T. Deisher, experto mundial en el uso de células madre con fines terapéuticos y terapia génica, que destaca la preocupación por los riesgos asociados con el uso de vacunas contaminadas con residuos. de células fetales humanas:

Dr. T. DEISHER (carta a los gobernantes - 8 de abril de 2019) 9 - (...) inyectar a nuestros hijos la contaminación del ADN fetal humano conlleva el riesgo de causar dos enfermedades bien establecidas:

  • mutagénesis insercional: El ADN fetal humano se incorpora al ADN del bebé causando mutaciones. La terapia génica con recombinación de fragmentos pequeños homólogos ha demostrado que cantidades tan pequeñas como 1,9 ng / mL de fragmentos de ADN resultan en la inserción de células madre en el genoma en el 100% de los ratones inyectados. Los niveles de fragmentos de ADN fetal humano en nuestros niños después de la vacunación con las vacunas MMR, VARIVAX (varicela) o hepatitis A alcanzan niveles superiores a 1,9 ng / ml.
  • enfermedad autoinmune: El ADN humano fetal estimula la reacción del sistema inmunitario para atacar el cuerpo del bebé.

Nuestros resultados fortalecen en gran medida las observaciones experimentales del Dr. Deisher y, sobre todo, el hecho de que el ADN fetal contaminante presente en todas las muestras analizadas en cantidades variables (por lo tanto, no controlado) es hasta 300 veces el límite de EMA para el ADN cancerígeno (10 ng / dosis, que corresponde al ADN contenido en aproximadamente 1000 células cancerosas, obtenido sobre la base de un cálculo estadístico, mientras que el límite de precaución es 100 pg / dosis), límite que debe aplicarse necesariamente también al ADN fetal que inevitablemente contamina el Priorix Tetra.

Se deduce que esta vacuna debe considerarse defectuosa y potencialmente peligrosa para la salud humana, en particular en la población pediátrica mucho más vulnerable al daño genético y autoinmune debido a la inmadurez en los sistemas de refugio.


  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/
  2. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
  3. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate.html
    https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate-en.html
  4. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
  5. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
  6. https://www.federalregister.gov/documents/2010/03/04/2010-4553/guidance-for-industry-characterization-and-qualification-of-cell-substrates-and-other-biological
  7. https://www.who.int/biologicals/vaccines/TRS_978_Annex_3.pdf
  8. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
  9. https://www.corvelva.it/approfondimenti/notizie/mondo/lettera-aperta-ai-legislatori-sul-dna-fetale-nei-vaccini-theresa-deisher.html