Tehnični odgovor na kritike dr. Buccija
Spodaj poročamo o tehničnem odzivu dr. Lorette Bolgan na kritike, ki jih je dr. Bucci objavil na Corvelva analizah.
Dragi dr. Bucci,
spodaj se odzivam na kritična vprašanja, ki ste jih zastavili zlasti v svojem članku, objavljenem na: BadScientists.com
Najprej bi vas rad opozoril, da uporaba tehnologij NGS / HTS (sekvenca naslednje generacije ali sekvenca z visokim pretokom) NI izvirna na zapletenih substratih biotehnološkega izvora, kot so cepiva.
NGS tehnologija je že bila uporabljena v cepivih, na primer:
- pri analizi komercialnih serij rotavirusnega cepiva (Victoria JG, Wang C, Jones MS, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S et al. Virusne nukleinske kisline v živo oslabljenih cepivih: odkrivanje manjšinskih različic in naključni virus. J Virol 2010; 84: 6033–40) omogočilo poznejšo blokado trženja serij, kontaminiranih s prašičjim cirkovirusom tipa 1 (PCV1), čeprav so predhodno prestali vse teste, potrebne za razvoj, klinična preskušanja in proizvodnjo (Dubin, G .; Toussaint, JF; Cassart, JP; Howe, B; Boyce, D .; Friedland, L; Abu-Elyazeed, R .; Poncelet, S; Han, HH; Debrus, S. Preiskava preiskave s strani regulativne agencije o potencialnem prašičjem cirkovirusu 1 kontaminacija cepiva proti humanemu rotavirusu, Rotarix: pristop in rezultat. Hum. Cepiva. Drugo, 2013, 9, 2398–2408).
- pri odkrivanju novega rabdovirusa v celični liniji Sf9 (MH, Galvin TA, Glasner DR, Shaheduzzaman S, Khan AS. Identifikacija novega rabdovirusa v celičnih linijah Spodoptera frugiperda. J Virol 2014; 88: 6576–85)
- pri prepoznavanju virusa cepiva proti mumpsu v možganih imunsko oslabljenega otroka, ki je umrl zaradi encefalitisa (Morfopoulou S, Mee ET, Connaughton SM, Brown JR, Gilmour K, Chong WK, Duprex WP, Ferguson D, Hubank M, Hutchinson C, Kaliakatsos M, McQuaid S, Paine S, Plagnol V, Ruis C, Virasami A, Zhan H, Jacques TS, Schepelmann S, Qasim W, Breuer J. Globoko sekvenciranje razkriva obstojnost virusa cepiva proti mumpsu pri kroničnem encefalitisu Acta Neuropathol. 2017 Jan; 133 (1): 139-147. Doi: 10.1007 / s00401- 016-1629-y. Epub 2016, 21. okt. PubMed PMID: 27770235).
Tudi v skupnem delu iz leta 2017 "Multicenter Study to Evaluate Performance of High -put Sekvencing for Virus Detection" (A Khan AS, Ng SHS, Vandeputte O, Aljanahi A, Deyati A, Cassart JP, Charlebois RL, Taliaferro LP. A Multicentrična študija za oceno uspešnosti zaporedja z visoko zmogljivostjo za odkrivanje virusov. MSphere. 2017, 13. september; 2 (5) .pii: e00307-17. Doi: 10.1128 / mSphere.00307-17. ECollection 2017, september, oktober, PubMed PMID : 28932815; PubMed Central PMCID: PMC5597969), je izpostavljeno, saj so analize, opravljene z različnimi HTS instrumenti, z različnimi protokoli priprave vzorcev in analize podatkov, na vzorcih, ki posnemajo kompleksne biološke materiale, pokazale podobno občutljivost pri odkrivanju virusov pri 3 več delavnic.
Nazadnje v „Poročilo mednarodne konference o sekvenci naslednjih generacij za naključno odkrivanje virusa v bioloških organizmih“ (Khan AS, Benetti L, Blumel J, Deforce D, Egan WM, Knežević I, Krause PR, Mallet L, Mayet D, Minor PD , Neels P, Wang G. Poročilo mednarodne konference o sekvenci naslednje generacije za odkrivanje naključnega virusa v bioloških bioloških bioloških izdelkih 2018. september; 55: 1-16. Doi: 10.1016 / j.biologicals.2018.08.002. Epub 2018 6. avg PubMed PMID: 30093175), poročilo o mednarodni konferenci, ki je potekala v Rockvilleu (MD) od 26. do 27. oktobra 2017, ki sta jo organizirala IABS (Mednarodno zavezništvo za biološko standardizacijo) in FDA (ameriška agencija za hrano in zdravila), v udeležilo se je osemindvajset znanstvenikov iz 16 različnih držav, vključno z raziskovalci Glaxo SmithKline, Merck in Sanofi, je navedeno, da:
„Glavne prednosti NGS za varnostne teste za odkrivanje virusov so hiter in neciljen pristop, ki ga je mogoče uporabiti v več substratih in omogoča odkrivanje širokega spektra virusov, vključno z različicami in novimi vrstami. ; in da ni potrebe po posebni amplifikaciji, medtem ko PCR zahteva ciljanje na določeno zaporedje "
In še enkrat:
"HTS tehnologije odkrivajo nekatere sedanje omejitve programov za preskušanje bioloških materialov in bi lahko v te programe vključile vrzeli ter povečale varnost izdelkov."
In v sklepih poročila beremo:
"Nenehna sodelovanja in znanstvena prizadevanja, izmenjave med regulativnimi agencijami in drugimi javnimi organi, industrijo, akademskimi laboratoriji in ponudniki storitev bodo napredovali na področju NGS z namenom zagotavljanja varnosti ekoloških proizvodov, ki vplivajo na zdravje ljudi in živali."
Spodaj odgovarjam na vaša opažanja, zlasti na tista, ki nam omogočajo, da bolje razložimo predhodne podatke, ki smo jih pripravili na nekaterih sejah Priorix Tetra.
Opomba 1
"Nekdo se sprašuje, kako je to prakso tajnosti v nasprotju s katerim koli merilom izmenjave podatkov mogoče uskladiti z nenehnimi zahtevami po preglednosti, ki sta jih glede varnosti cepiva postavili združenje CORVELVA in predsednik Nacionalnega reda biologov: je zakonito sproži alarm, ne da bi zagotovil vse podatke, potrebne za oceno njegove skladnosti?
Kako lahko znanstvena skupnost in državljani ocenijo težo nekaterih zahtevkov, če se popolni izvirni podatki hranijo v tajnosti, dokler javni tožilec ne bo odločil, ali in kako nadaljevati s sodnim dejanjem? "
Odgovor 1
Podatki metagenomije, ki jih je Corvelva razkrila za cepivo Priorix Tetra (MPRV) in so bili obravnavani v poročilu, objavljenem decembra, so bili predhodni (posodobljena različica je bila objavljena na spletni strani Corvelva 23. januarja, rezultat nadaljnjega koraka v analizi podatkov), ker so, kot je bilo že večkrat omenjeno, do zdaj razkriti podatki rezultat procesa raziskav in tehnološkega razvoja, ki se je začel leta 2017, s ciljem natančne prilagoditve in optimizacije celotnega postopka, od obdelave vzorca do analize bioinformatike. Rezultate je bilo razkriti med delom, ko bodo na voljo, v popolni preglednosti (ravno nasprotno tistemu, kar ste deklarirali kot "prakso tajnosti") in v vsakem primeru močno podprto z znanstveno literaturo o tem "argument.
Po našem mnenju to, kar smo doslej razkrili o tem cepivu, zlasti glede velike količine človeške plodove DNK, ni nič novega ali nepričakovanega in najmanj neznano farmacevtskim družbam.
Opomba 2
„Zlahka je razvidno, da je skupno število odčitanih levic v zgornjem levem kotu (označeno z rumeno) več kot 6 milijonov; vendar je vsota vseh odčitkov, razdeljenih po razredu organizma, enaka približno 5 milijonom in pol, "primanjkljaj" pa je več kot 700.000 prebranih (in odstotek vsote, označen z rdečim poljem, enak 88%). Ta preprost dodatek, ponovljen na vseh tabelah, postavlja vprašanje, kje se je končalo manjkajoče branje (odstotek, ki zagotovo ni zanemarljiv) in zakaj niso poročali. Možnost, da so raziskovalci naredili napako, ostaja jasno odprta. "
Odgovor 2
Recimo, da 700.000 prebranih bolj ali manj rahlo spremeni vsebino predhodnih presejalnih analiz. Manjkajoče sekvence so vključene v izračun zaporedja, ki niso dodeljene. Kot že rečeno, podatki niso dokončni in v poročilih lahko pride do netočnosti. Vse bo pregledano in popravljeno, ko delo napreduje.
Opomba 3
»Genom virusa rdečk, enega od oslabljenih virusov, potrebnih za podeljevanje imunogenosti, ne bi bil prisoten. Odkrivanje mikroorganizma v preiskovanem vzorcu pri zelo nizkih ravneh, na meji statističnega hrupa, torej ni odvisno od njegove odsotnosti, temveč od neoptimizirane metode identifikacije. Enake, enake težave je mogoče ugotoviti pri identifikaciji katerega koli drugega genoma, za katerega analitska metoda ni bila ustrezno kalibrirana; pomanjkanje razkritja genoma virusa rdečk (poleg tega enkapsuliran virus z eno vijačnico) je torej mogoče pripisati uporabljeni metodi, ne da bi se bilo treba sklicevati na njegovo odsotnost v preučenih serijah cepiv. "
Odgovor 3
Njegova teza je sprejemljiva. Smo v fazi raziskav in razvoja, vendar je tehnologija zelo robustna in priznana v znanstveni skupnosti, ki se ukvarja z globokim zaporedjem za odkrivanje virusov v kompleksnih bioloških substratih. Medlaboratorijski testi in uvedba ustreznih certificiranih standardov za virusno mešanico nam bodo omogočili, da preverimo ali ovržemo predlagano hipotezo, to je, da metoda še ni (še) optimizirana za viruse.
Vsekakor so genom rdečk našli v preiskovani seriji, s čimer se je povečala globina sekvenciranja (114 seznamov s pari na koncu 125 bp, od približno 260 milijonov proizvedenih sekvenc), kot je opisano v drugem poročilu januarja 2019. Tudi v cepivu MMRVax Pro iz Mercka, ki so ga leta 2017 analizirali z isto metodo, so našli genom virusa rdečk, ne da bi se morali spuščati v tako velike globine, kar dokazuje, da metoda deluje.
Opomba 4
"Odkrili bi genome številnih kontaminirajočih organizmov, ki pripadajo številnim taksonom, vključno s helminti, bakterijami in naključnimi človeškimi patogenimi virusi. Nadaljnja težava je tudi v predstavljenih tabelah, ki sestoji iz obilne frekvence zaporedij, ki jih je mogoče pripisati virusom, integriranih v človeški genom (endoviruse različne narave), ali retrovirusnih sekvenc, za katere je znano, da jih najdemo v običajnem človeškem genomu (to je na primer sekvenca integrirani retrovirusi, ki jih je mogoče zamenjati z virusom HIV) ali v genom piščančjih embrionalnih celic, ki se uporabljajo za proizvodnjo cepiva, običajno najdemo kot napačne dodelitve kontaminirajočih genomov v sekvenciranju DNK ali RNK, odvisno od posamezne obravnavane endosekvencije. Najprej so v tabelah poročila naštete številne vrste, ki jih najdemo na podlagi številnih odčitkov, ki so v celoti vključeni v statistični hrup. 3 ali manj branja je tvegan postopek, ki vodi do velikega števila napačnih pozitivnih rezultatov. "
Odgovor 4
Različica poročila, objavljenega decembra na spletni strani Corvelva, na katero se sklicujete, je bila pred kratkim posodobljena z različico, v kateri je bil del onesnaževalcev predhodno potrjen z alternativno programsko opremo in nato ročno. Prva analiza je bila namerno izvedena brez filtrov, da bi izpostavili vse mogoče signale in vse težave, povezane z „odprto“ analizo. Namen našega dela ni, kot smo že večkrat ponovili, opraviti analizo sproščanja serije, temveč opraviti predhodni pregled in nato medlaboratorijsko potrditev kritičnih vprašanj, ki so se pojavila, z uporabo uveljavljene tehnologije na terenu. Genomic, ki jih že uporabljajo na cepivih in v prihodnosti tudi s strani regulativnih agencij in velikih farmacevtskih podjetij za povečanje kakovosti in posledično varnosti izdelka.
Če določite mejo treh odčitkov (na podlagi česa?), Bi si lahko vsaj mislili, da so znaki prisotnosti endogenih retrovirusov v tem cepivu verjetni (človeški endogeni retrovirus K: 3 odčitkov 32bp, kar ustreza 125bp in HERVH- env 4000: 62 branja, kar ustreza 4bp), v podatkih sekve RNA, ki po definiciji predstavljajo prepisani in s tem potencialno aktivni material.
Namesto tega se strinjam z vami, da so lahko retrovirusne sekvence, ki jih najdemo v podatkih sekve DNA, provirusi, integrirani v človeški genom, glede na zelo veliko človeške DNK v zadevnem cepivu.
Spomnim se, da so bile pri cepivu proti Attenuvaxu (cepivo proti ošpicam) 4 sekvence, ki pokrivajo 700 bp (Victoria JG, Wang C, Jones MS, Jaing C, McLoughlin K, Gardner S in drugi. Virusne nukleinske kisline v živo oslabljenih cepivih: odkrivanje različice manjšin in naključni virus J Virol 2010; 84: 6033–40), ki je z NGS prvič odkril okužbo z virusom ptičje levkoze (ALV) na cepivu, nato pa jo potrdil z ugnezdenim PCR.
Opomba 5
"Kar zadeva prvi od teh potencialnih onesnaževalcev, je nepatogena bakterija, ki fiksira dušik, Bradyrhizobium, njen" pojav "v laboratorijih za zaporedje znana je kot težava, povezana s pripravo vzorcev za sekvenciranje, ki se pripiše onesnaženju kompletov za čiščenje DNK, vode in reagentov, ki jih je treba uporabiti. Dobro znana težava, pri kateri je pri delu "raziskovalne" genomike vzporedno z vzorcem, ki se pregleduje, zaporeden kontrolni vzorec, na primer z vodo. "
Odgovor 5
Beljaki so bili narejeni (tako iz ekstrakcije kot iz knjižnice), vendar knjižnice niso bile pridobljene, zato jih ni bilo mogoče voditi na sekvenci, da bi preverili, kaj je z reagentom / onesnaženjem iz okolja. Vendar si prizadevamo razumeti, kaj so "fiziološka" onesnaženja, medlaboratorijski testi pa bodo pomagali tudi pri določanju možnih laboratorijsko odvisnih bakterijskih okužb.
Opomba 6
„Kar zadeva dve vrsti črvov, ki sta bili odkriti v analizi sekvenciranja RNA, je dovolj, da opazimo, kako nista prisotni v ustreznih analizah zaporedja DNK, kjer bi jih bilo treba veliko bolje zaznati; posledično se dejanska prisotnost obeh vrst kaže kot artefakt, česar ni mogoče potrditi glede na enake podatke o zaporedju DNK.
Glede na podane pomisleke torej ni mogoče potrditi prisotnosti katerega koli prijavljenega onesnaževalnega genoma in obstajajo močni namigi, zaradi katerih razmišljamo o prisotnosti številnih lažnih pozitivnih rezultatov. "
Odgovor 6
Druga različica poročila je že zagotovila prvo potrditev nekaterih najdenih organizmov, tako z alternativno programsko opremo, kot tudi ročno.
Ocenjevanje napačnih atribucij programske opreme Kraken (poleg tega je najpogosteje uporabljena programska oprema znanstvene skupnosti za metagenomske analize celotnega genoma) za razvoj ad hoc cevovoda za bioinformatiko za to vrsto analiz, ki ne zahteva uporabe drugih. programska oprema in ročni pregled (poleg tega pogost na področju metagenomije za najsodobnejše težave zaradi odsotnosti posebnih in posebej natančnih baz podatkov).
Opomba 7
"Zaznana človeška DNK bi bila z visoko molekulsko maso in pokritost človeškega genoma bi bila popolna, tako da bi bil na preiskanih serijah cepiva prisoten celoten genom celic človeškega ploda in ne njegovi deli.
"V cepivu Priorix Tetra ima človeška genomska DNA visoko molekulsko maso (> 10.000 bp) in celotno zaporedno pokrivanje celotnega referenčnega človeškega genoma (HG-19) kaže, da gre za celoten genom plodovih celic, ki se uporablja za prisotna kultura cepivnega virusa in ne le njihovi deli. "
Za navedeno izjavo ni podanih neposrednih dokazov, ne da bi to posegalo v prisotnost DNK, ki tehta približno 100.000 baz, ki jih avtorje geloško elektroforezo razkrijejo (dokumentirani s slabo kakovostno številko v dokumentu CORVELVA, od katerih bi bilo priporočljivo pridobiti visoko izvirno ločljivost za oceno, ali so podatki predstavljeni nepoškodovano).
Vendar avtorji pozabljajo, da je DNK nekaterih oslabljenih virusov, ki so prisotni v zadevnem cepivu, približno enake velikosti, kot so jo razkrili v gelu (na primer, DNK virusa norice je 125 kb); zato, tudi če želite na predstavljeni gelski sliki videti sled DNK z veliko težo, lahko to jasno pripišemo DNK oslabljenih virusov, prisotnih v cepivu, in ne drobcem človeške DNK. Spet se srečujemo s preveliko interpretacijo eksperimentalnega rezultata. Kar zadeva drugi element, na katerem temelji trditev CORVELVA, to je, da bi bil celoten človeški genom prisoten v cepivih, ne pozabimo, da za tehtanje njegove doslednosti sploh ni treba imeti dostopa do podrobnih podatkov o pokritju: globino uporabljenega zaporedja in glede na število prebranih prebranih navedb je ta stavek povsem neverodostojen. Poleg tega uporabljena tehnika sekvenciranja, ki temelji na kratkih sekvencah 125 nukleotidov, ne omogoča določitve, ali je genom razdrobljen. Uporabljena tehnika zaporedja omogoča le oceno deleža sekvencirane genomske DNK "
Odgovor 7
Človeška DNK v tem cepivu je približno 8 do 1 glede na DNA norice (88% odčitkov je človeškega izvora v primerjavi z 11% piščančjih pox v zadnji analizirani seriji A71CB256A). Drugih oslabljenih virusov dsDNA ni v cepivu, ker so virusi ošpic, mumpsa in rdečk enojni verigi RNA, ki jih ni mogoče videti na agaroznem gelu. NGS je kvantitativna tehnologija, zato nam omogoča preprosto fluorimetrično količinsko določitev celotne DNK, odvzete iz cepiva (npr. Serija A71CB256A = 3,7 mikrogramov na odmerek), povezano z upoštevanjem zgoraj navedenega relativnega količinskega merjenja (8: 1). da lahko rečemo, da je celična DNK približno 2,9 mikrogramov na odmerek, v primerjavi s približno 0.74 mikrograma DNK piščančjih. Zato je verjetno, da je vsaj del DNK z visoko molekulsko maso, ki je viden na gelu, lahko tisti iz celice plodove celične linije MRC5.
Neposredni dokazi, da znotraj tega izdelka obstaja popolni človeški genom (to je z nekodirajočimi geni in sekvencami), razdrobljen ali ne, so podani z rezultatom poravnave odčitanih človeških odčitkov na človeško referenco hg19.
Naslednja tabela, označena z oranžno, prikazuje rezultat, izražen v 'Av_cov = povprečna pokritost' poravnave človeških zaporedij treh serij preskušenega Priorixa (3., 1. in 2. serija) na človeških kromosomih. V stolpcu 3 je chrM mitohondrijska DNA, medtem ko so Chr1 do ChrY sestavljeni človeški kromosomi, vključno s spolnima kromosomoma X in Y. Stolpec 1 prikazuje dolžino sestavljenih človeških kromosomov, izraženih v baznih parih.
Pokritost je nizka (povprečno Avg_cov vzdolž vsakega kromosoma <od 1x), vendar je homogenost porazdelitve odčitkov, ki se ujemajo enolično, vzdolž vseh človeških kromosomov in prisotnost odčitkov, ki se ujemajo z večjo pokritostjo na genomu mitohondrijski (v človeških celicah sta 2 genoma, en jedrski približno 3Gbp velik in razdeljen na kromosome in en manjši, krožni, približno 16Kbp mitohondrijski), pa nam omogoča nesporno prepoznati situacijo, podobno zaporedju genoma nizkega pasu človeškega genoma posameznik. Za lažje razumevanje navedenega je v delu, označenem z zeleno, nekaj človeškega nizkoprepustnega zaporedja celotnega genoma (5 vzorcev, 4 samice in 1 moški) v globini, podobni tisti, ki je bila proizvedena za 3 cepiva Priorix Tetra.
Navedbo spola posameznika (najverjetneje moškega) v cepivu je mogoče razbrati tudi iz razmerja med povprečno pokritostjo za kromosom X in Y.
Človeška DNK, ki je bila vsebovana v predhodno zaporednih sklopih zdravila Priorix, je bila prav tako opredeljena kot pripadnost plodove linije MRC-5, ki je neprekinjena celična linija iz pljučnega tkiva moškega abortivnega zarodka iz 60. let, v katerem je virus norice in rdečkice. Analiza različic mitohondrijske DNA, prisotne v cepivu, v primerjavi z mitohondrijsko DNK linije MRC-5 (DNK celične linije je bila kupljena od ATCC, glavnega vira standardnih bioloških materialov na svetu), kaže, da gre za istega posameznika.
Opomba 8
"Že dolgo obstajajo dokazi, da tudi zelo visoki odmerki človeške DNK ne morejo povzročiti pomembnih tveganj tudi v dolgih obdobjih opazovanja, kar potrjuje študije na primatih razen človeka, iz kliničnih izkušenj s cepivi in drugimi biološkimi zdravili ter iz nedavne študije o oceni tveganja ki kažejo, da so tudi v tistih neevropskih državah, kjer so pragovi za količino DNK, ki jih je mogoče vbrizgati, nepotrebno strogi. "
Odgovor 8
Članek iz leta 1995 (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104510568570036X?via%3Dihub), ki ga navajate, se nanaša na študijo o primatih, ki po mojem mnenju zagotovo ne zadostuje za dokazovanje odsotnosti infektivnosti, onkogenosti in avtoimunosti človeške DNK, ki se vbrizga v otroke, kot so isti avtorji navedli v zadnjem delu razprave. V poskusu se v opice vbrizga velika količina človeške DNK, torej ne DNK iste vrste.
Drugi citirani članek (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23569076) zelo jasno navaja, da je preostala DNA kužna na dva mikrograma, čeprav je v vsakem primeru ta meja pridobljena iz statistične ocene in ne iz eksperimentalnih podatkov. V vsakem primeru bi po navodilih avtorja količina cepiva Priorix količino fetalne DNK jasno ustrezala tisti, ki je določena kot tveganje za nalezljivo bolezen.
Merck za cepivo proti Varivaxu (piščančja strupa, živi oslabljen virus) v ameriškem zloženki izjavlja, da je človeška plodova DNK, pridobljena iz celic MRC-5, za katero se zdi, da je v analizah, ki jih je opravil dr. Deisher, v količini približno dva mikrograma.
V primeru italijanskega letaka Priorix Tetra pa ni nakazano, da je prisotna DNK linije MRC-5, čeprav je v količinah enakega obsega, kot jih je vseboval ameriški Varivax. Vsekakor dva mikrograma plodove DNK MRC-2 po mojem mnenju nista preostala količina, ampak resnična sestavina cepiva.
Študije in vitro doktorja Deisherja, za katere upamo, da bodo kmalu objavljene, na žalost kažejo zmedene rezultate, ko cepivo, ki vsebuje fetalno človeško DNK (hipometilirano), in vitro inkubira s človeškimi hematopoetskimi matičnimi celicami. A čakamo, da se objavi raziskava in potem se lahko ponovno srečamo na to temo.
Loretta Bolgan *
* Doktor kemije in farmacevtskih tehnologij, z doktoratom iz farmacevtskih znanosti s harvardske medicinske šole v Bostonu. Delala je v sektorju farmacevtske industrije, kjer se je ukvarjala z registracijo in razvojem raziskovalnih projektov na področju onkologije. Svetovalec dela zakona 210/92 o onesnaževanju okolja in poklicnih boleznih je sodeloval pri zadnji parlamentarni preiskovalni komisiji o osiromašenem uranu v skupini cepiv. Sedanja svetovalka pri nacionalnem redu biologov za toksikologijo zdravil in cepiv se ukvarja tudi s prehrano in dopolnilnimi terapijami.