Kratka predstavitev rezultatov

Danes predstavljamo nadaljnjo in zelo pomembno poglobljeno študijo genomskega zaporedja celične linije, ki smo jo našli v štirivalentnem cepivu MPRV (proti ošpicam, rdečkam, mumpsu in noricam) Priorix Tetra® in celični liniji MRC-5 ( tisto, ki se deklarira pri razvoju samega cepiva).

Povzemanje predhodnih objavljenih poročil: 

1. Najprej smo dokazali, da je količina DNK v zgoraj omenjenem cepivu precej nad dovoljenim pragom;  
2. Drugič, preverili smo, da je celična linija dejansko prijavljeni MRC-5; 2
3. Nazadnje smo izvedli sekvenciranje genoma celične linije, neposredno pridobljenega iz cepiva, in poudarili večje mutacije, ki odpirajo možnost resnih zdravstvenih tveganj pri uporabi tega cepiva.

Tukaj predstavljamo natančno primerjalno delo med obema genoma: tistim, ki smo ga dejansko našli znotraj cepiva, in tistim, ki smo ga kupili pri mednarodni banki celičnih linij kot MRC-5.

Rezultat je, da obe vrstici kažeta pomembne razlike z vidika genetske stabilnosti. Zlasti je genom cepiva bistveno spremenjen v primerjavi s celično linijo, registrirano leta 1966.

To pomeni, da so proizvajalci Priorix Tetra® v tem primeru kupili celično linijo v optimalnih pogojih z vidika genske stabilnosti in s čezmerno neprekinjeno uporabo v proizvodne namene tržili cepiva, ki vse bolj in bolj vsebujejo spremenjen človeški genetski material, ki je nevaren za zdravje cepiv.

Ker regulativne agencije ne potrebujejo periodičnega spremljanja genske stabilnosti plodovih linij in niti ne določijo minimalnega varnostnega praga, lahko sklepamo, da temeljna zahteva za kakovost in varnost cepiv, pridobljenih iz človeških celičnih linij, ni bila izpolnjena za že nekaj časa, in sicer je treba preveriti, ali ne razvijejo potencialno nevarnih mutacij in preureditev, in zagotoviti odstranjevanje ostankov predelave genskega materiala, če obstajajo. 

Ni naša odgovornost, da določimo, kateri del proizvodnje ali konzerviranja bi lahko vplival na kakovost in varnost izdelka, ampak tisto, kar lahko danes potrdimo z objavo tega poročila, je nujna za temeljito preučitev rezultatov naših analiz. smo bili v zadnjih dveh letih obveščeni, da se osredotočamo na končni izdelek, prodajo in upravljamo in ne le na posamezne dovoljene "sestavine".

Še enkrat želimo spomniti, da so ti izdelki del italijanskega načrta cepljenja in da so trenutno pooblaščeni za pediatrično populacijo pri nas, pa tudi v drugih evropskih državah in na splošno po vsem svetu.

Regulativne agencije imajo veliko odgovornosti v zvezi z varnostjo, ki jo trenutno postavljamo z besedami, vendar v praksi in, kot kažejo naše analize, tega ni mogoče zagotoviti in dejansko ni zagotovljeno.

---

Krožni prikaz genomov (circos plot)

Spodaj je prikazan grafični prikaz obeh genomov, imenovanih „cirkonska ploskev“.

Pojasnilo različnih koncentričnih krogov

1. Zunanji krog (prvi krog) je število kromosomov.
2. Drugi obroč (modri) predstavlja pokritost branja v slogu histograma. Vsak histogram je povprečna pokritost območja 0.5 Mbp.
3. Tretji obroč (črn) predstavlja gostoto INDEL-ov v slogu "disperzijski graf". Vsaka črna pika se izračuna kot število INDEL-ov (majhnih vstavitev / izbrisov) v območju 1 Mbp.
4. Četrti obroč (zelen) predstavlja gostoto snp v slogu "disperzijski graf". Vsaka zelena pika se izračuna kot število SNP-jev (različice z enim nukleotidom) v območju 1 Mbp.
5. Peti obroč predstavlja delež SNP-jev v homozigotnosti (oranžna) in heterozigotnosti (siva) v slogu histograma. Vsak histogram se izračuna iz regije 1 Mbp.
6. Šesti obroč predstavlja sklepanje CNV (različice v številu izvodov). Rdeča pomeni pridobitev kosov DNK, zelena pa izgubo.
7. Najbolj osrednji obroč predstavlja sklepanje o SV (strukturne različice) v heksagonalnih in spojnih območjih. TRA (oranžna, premestitve), INS (zelena, vstavki), DEL (izbrisi, siva), DUP (podvojitve, roza) in INV (inverzije, modra).

---

zaključek

Genom imata pomembne razlike. Zdi se, da je genom cepiva resno mutiran v primerjavi s celično linijo, deponirano leta 1966. Treba je povedati, da nismo imeli možnosti zaporedja celične linije, ki jo GlaxoSmithKline uporablja za proizvodnjo cepiva Priorix Tetra®, ampak ena prvotna zaloga.

Farmacevtska podjetja, ki uporabljajo celične linije za proizvodnjo zdravil in cepiv, imajo svojo linijo MRC-5, vendar to dejstvo ne spreminja našega dvoma, to je, da ni periodične zahteve za spremljanje genske stabilnosti in to je veliko vprašanje v našem pogled, zlasti zato, ker je to dovoljeno brez omejitve praga.

---

Prenos: CORVELVA-Priorix-Tetra-človek-genoma-in-MRC-5-celično line.pdf

---

Priorix Tetra® človeški genom in MRC-5 celična linija - primerjalna študija (ATCC standard MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

Prisotnost virusa rdečk je bila dokazana z sekvenciranjem RNA-seq knjižnice z izjemno veliko globino (približno 260 milijonov sekvenc, ki jih je proizvedla Illumina). Zaznanih je bilo 114 sekvenc v 260 milijonih, kar je 0.00004% celotnih sekvenc. Zaporedja genoma rdečk so nato ročno potrdili s programsko opremo BLAST (Osnovno orodje za lokalno poravnavo, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Knjižnica, zaporedna na manjši globini (približno 12 milijonov sekvenc ujemanja Illumina, kar je 6 milijonov fragmentov knjižnice, zaporedja), v tej seriji ni zaznala prisotnosti VSEBNOSTI, ki jih je mogoče pripisati rdečkam.

Na enak ročni način so potrdili tudi druge virusne sekvence cepiva (norice, ošpice in mumps), ki potrjujejo, da so bile pravilno dodeljene.

---

Predstavitev

Sekvence nove generacije so postale izbirno orodje za podrobne analize na področju biologije in medicine, še posebej natančne. Ta orodja omogočajo nov in bolj globalen pristop k vrsti aplikacij, kot so novo zaporedje, metagenomija, epigenomika, zaporedje transkriptov in ponovno zaporedje genomov.

Slednja uporaba (ponovno zaporedje) je na človeškem področju zelo razširjena tako v raziskovalne kot diagnostične namene in je sestavljena v sekvenciranju s tehnologijo NGS (Next Generation Sequencing) celotnega posameznega genoma z namenom preslikave posameznih nukleotidnih mutacij (SNP, izgovorjava. " snip '), so se na določenih položajih genoma pojavljale vstavitve in izbrisi bolj ali manj dolgih sekvenc in razlike v številu kopij delov gena / genov (CNV, različice kopijskih številk).

Postopek zaporedja zahteva, da se DNK posameznika mehansko razbije na drobce majhne velikosti (400-500 bp), ti fragmenti pa so povezani s trakti umetne DNK, imenovane adapterji, ki omogočajo pritrditev drobcev človeške DNK na stekleno površino na katerih se potem odčitajo podlage (A, C, G, T).

Odčitavanje DNK je pridobljeno z vključitvijo kemijskih reakcij nukleotidov, označenih s fluorescenčnimi molekulami. Milijoni sekvenc (odčitkov), ki jih dobimo s sekvenciranjem na stekleni površini, se nato preskusijo na referenco človeškega genoma z ustrezno programsko opremo, nato pa se identificirajo vse različice, ki so prisotne v analiziranem genomu v primerjavi z referenco.

Ta isti postopek je bil izveden na človeškem genomu, ki je prisoten v seriji Priorix Tetra® n. A71CB256A in na DNK, odvzeti iz celične linije MRC-5, registrirano leta 1966 pri ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC je vodilna svetovna organizacija virov in standardov bioloških materialov, katerih poslanstvo se osredotoča na pridobivanje, preverjanje pristnosti, proizvodnjo, ohranjanje, razvoj in distribucijo referenčnih mikroorganizmov, celičnih linij in drugih bioloških standardnih materialov. Ustanovljen je bil leta 1925, ko je odbor znanstvenikov prepoznal potrebo po centralizirani zbirki bioloških materialov, ki bi lahko služila znanstvenikom po vsem svetu.

Celična linija MRC-5 izhaja iz običajnega pljučnega tkiva 14-tedenskega moškega ploda in jo je odložil JP Jacobs septembra 1966. Te celice so bile razglašene, da lahko pred staranjem podvojijo od 42 do 46 populacije. začne. Referenčni članek za to celično linijo sega v leto 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0

---

Rezultati

Kot smo že pokazali, je človeška DNK, prisotna v seriji Priorix Tetra®. n. A71CB256A (v naslednjih grafih je označen kot "vzorec ID12051PT") je celoten individualni genom, to pomeni, da je prisotna genomska DNK vseh kromosomov moškega. Grafi pokritosti (povprečna globina = povprečna pokritost) 22 človeških kromosomov in kromosomov X in Y so prikazani spodaj, za cepivo (slika zgoraj) in celico MRC5 (slika spodaj).

 

Spodaj so prikazani rezultati analize različnih vrst različic.

---

Polimorfizem enojnega nukleotida (SNP) in kratke vstavke / delecije (InDels)

Različice posamezne DNK (SNP, izgovorjeno "snip") so polimorfizmi, torej različice genskega materiala, ki jih prenaša en sam nukleotid. 'InDels' so majhni vstavki in izbrisi dolžine manj kot 50 bp in predstavljajo drug razred genomskih različic v človeškem genomu.

SNP (enojni nukleotidni polimorfizem) - ID12051PT

---

SNP (enojni nukleotidni polimorfizem) - MRC-5

---

InDels (kratki vstavki / izbrisi) - ID12051PT

---

InDels (kratki vstavki / izbrisi) - MRC-5 

---

CNV (različice številk za kopiranje) in SV (strukturne različice)

Različice različic kopij (CNV) so genomske različice zaradi variacij v številu kopij relativno velikih fragmentov (daljših od 50 bp) v posameznih genomih. Obstajata dve vrsti CNV: vrsta 'pridobitev' (kopija dobiček) in 'izguba' (izguba kopij).

Strukturne variante (SV) so genomske variante z razmeroma velikimi dimenzijami (> 50 bp), vključno z izbrisi, podvajanjem, vstavitvami, inverzijami in translokacijami.

CNV (različice številčnih kopij)

---

SV (strukturne različice)

---

Krožna vizualizacija genomov (circos plot)

Spodaj je prikazan grafični prikaz obeh genomov, imenovanih (cirkonski zaplet).

---

Pomen različnih koncentričnih krogov

1. Zunanji krog (prvi krog) je število kromosomov.
2. Drugi obroč (modra) predstavlja pokritost odčitkov v slogu histograma. Vsak histogram je povprečna pokritost območja 0,5 Mbp.
3. Tretji obroč (črn) predstavlja gostoto INDEL-ov v "disperzijskem grafu". Vsaka črna točka se izračuna kot število INDEL-ov (majhnih vstavkov / izbrisov) v območju 1 Mbp.
4. Četrti obroč (zelen) predstavlja gostoto snp v "disperzijskem grafu". Vsaka zelena pika se izračuna kot število SNP (enojnih nukleotidnih polimorfizmov) v območju 1 Mbp.
5. Peti obroč predstavlja delež homozigotnega (oranžnega) in heteroroznega (sivega) SNP v histogramskem slogu. Vsak histogram se izračuna iz 1 Mbp regije.
6. Šesti obroč predstavlja sklepanje CNV (različice številčnih kopij). Rdeča pomeni, da kosi DNK pridobijo, zelena pa izgubo.
7. Najbolj osrednji obroč predstavlja sklepanje SV (strukturne variante) v eksoničnih in spajkalnih območjih. TRA (translokacija, oranžna), INS (vstavki, zelena), DEL (brisanje, siva), DUP (podvajanja, roza) in INV (inverzije, modra).

---

Sklepi

Ta dva genoma kažeta pomembne razlike. Konkretno, izkazalo se je, da je genom cepiva močno spremenjen v primerjavi s celično linijo, deponirano leta 1966. Povedati je treba, da nismo imeli možnosti, da bi izvedli sekvenciranje celične linije, ki jo je GlaxoSmithKline uporabljal za proizvodnjo cepivo Priorix Tetra®, vendar prvotno na zalogi. Farmacevtska podjetja, ki uporabljajo celične linije za proizvodnjo zdravil in cepiv, imajo svojo linijo MRC-5, vendar to ne spreminja naših sumov, torej dejstvo, da občasno ni potreben nadzor genetske stabilnosti, je po našem mnenju zelo resno. zlasti zato, ker je dovoljeno, da je navzoč brez mejnega praga.

 

---

sklepi

Oba genoma kažeta pomembne razlike. Zlasti se izkaže, da je genom cepiva močno spremenjen v primerjavi s celično linijo, deponirano leta 1966. Treba je povedati, da nismo imeli možnosti zaporedja celične linije, ki jo uporablja GlaxoSmithKline za izdelavo cepiva Priorix Tetra, toda zaloge original. Farmacevtske družbe, ki uporabljajo celične linije za proizvodnjo zdravil in cepiv, imajo svojo linijo MRC-5, vendar to ne spreminja naših sumov, to je dejstvo, da obvladovanje genske stabilnosti občasno ni potrebno in je po našem mnenju zelo resno predvsem zato, ker je dovoljeno biti navzoč brez omejitev.