Kratka predstavitev rezultatov

Danes predstavljamo nadaljnjo zelo pomembno študijo genomskega zaporedja celične linije, ki jo najdemo v štirivalentnem cepivu MPRV (ošpice, rdečkice, mumpsu in piščančji strupi) Priorix Tetra, ter celične linije MRC-5 (ki je deklarirano uporabljena pri razvoju cepivo samo).

Povzemanje prejšnjih objavljenih poročil: 

1. najprej smo pokazali, koliko je DNK v omenjenem cepivu je bil precej nad dovoljenim;  
2. nato smo preverili, da je celična linija pravzaprav prijavljeni MRC-5; 
3. naknadno smo nadaljevali sekvenciranje genom celične linije, ekstrahirane neposredno iz cepiva, s poudarkom na zelo težkih mutacijah, ki pomenijo resno tveganje za zdravje pri uporabi tega cepiva.

Tukaj predstavljamo natančno primerjalno delo med obema genoma: tisto, kar smo res našli v cepivu in MRC-5, kupljeno iz baze podatkov ATCC.

Rezultat tega je, da obe vrstici predstavljata pomembne razlike z vidika genske stabilnosti. Zlasti je videti, da je genom cepiva močno spremenjen v primerjavi s celično linijo, deponirano leta 1966.

To pomeni, da so proizvajalci v tem primeru priorix tetre kupili celično linijo v optimalnih pogojih z vidika genske stabilnosti in z nenehno uporabo skozi čas za proizvodnjo postopoma dajali na trg cepiva, ki vsebujejo človeški genetski material. vse bolj spremenjena in nevarna za zdravje cepljenih. 

Ker regulativne agencije ne zahtevajo občasnega nadzora genske stabilnosti plodovih linij in niti ne določijo minimalnega varnostnega praga, lahko sklepamo, da je temeljna zahteva za kakovost in varnost cepiv, ki so bila pridobljene iz človeških celičnih linij, torej potrebo po preverjanju, da ne pridobijo potencialno nevarnih mutacij in preureditev, in po zagotovitvi izločanja ostankov predelave genskega materiala, če obstajajo.

Ni nam treba določiti, kateri del proizvodnje ali konzerviranja lahko vpliva na kakovost in varnost izdelka, ampak tisto, o čemer lahko danes pričamo z objavo tega poročila, je, da je treba nadzorne organe nujno temeljito pregledati rezultate, ki so jih izpostavile naše analize. v teh dveh letih se je pozornost usmerila na končni izdelek, ki se prodaja in uporablja, in ne le na posamezne dovoljene "sestavine".

Še enkrat ne pozabite, da so ti izdelki del italijanskega koledarskega cepljenja in jih trenutno obvezno dajemo pediatrični populaciji naše države, pa tudi drugih evropskih držav in na splošno po vsem svetu.

Nadzorni organi imajo ogromno odgovornost za varnost, ki jo trenutno napovedujejo z besedami, vendar v resnici očitno in, kot izhaja iz naših analiz, ni mogoče zagotoviti in je resnično ne upoštevamo.

Krožna vizualizacija genomov (circos plot)

Spodaj je prikazan grafični prikaz obeh genomov, imenovanih „cirkonska ploskev“.

Pomen različnih koncentričnih krogov

1. Zunanji krog (prvi krog) je število kromosomov.
2. Drugi obroč (modra) predstavlja pokritost odčitkov v slogu histograma. Vsak histogram je povprečna pokritost območja 0,5 Mbp.
3. Tretji obroč (črn) predstavlja gostoto INDEL-ov v slogu 'disperzijskega grafa'. Vsaka črna točka se izračuna kot število INDEL-ov (Majhne vstavke / brisanja) v območju 1 Mbp.
4. Četrti obroč (zelen) predstavlja gostoto snp v 'disperzijskem grafu'. Vsaka zelena pika se izračuna kot število SNP-jev (posamezne nukleotidne variante) v območju 1 Mbp.
5. Peti obroč predstavlja razmerje homozigosti (oranžna) in heterozigotičnosti (siva) SNP v slogu histograma. Vsak histogram se izračuna iz 1 Mbp regije.
6. Šesti obroč predstavlja sklep CNV (Različice v številu izvodov). Rdeča pomeni pridobivanje kosov DNK, zelena pa izgubo.
7. Najbolj osrednji obroč predstavlja sklepanje SV (strukturne variante) v eksoničnih in spajkalnih območjih. MED MED (oranžna, translokacije), INS (zelena, vstavki), DEL (črtanja, siva), DUP (podvajanja, roza) in INV (inverzije, modra).

sklepi

Oba genoma kažeta pomembne razlike. Zlasti se izkaže, da je genom cepiva močno spremenjen v primerjavi s celično linijo, deponirano leta 1966. Treba je povedati, da nismo imeli možnosti zaporedja celične linije, ki jo uporablja GlaxoSmithKline za izdelavo cepiva Priorix Tetra, toda zaloge original. Farmacevtske družbe, ki uporabljajo celične linije za proizvodnjo zdravil in cepiv, imajo svojo linijo MRC-5, vendar to ne spreminja naših sumov, to je dejstvo, da obvladovanje genske stabilnosti občasno ni potrebno in je po našem mnenju zelo resno predvsem zato, ker je dovoljeno biti navzoč brez omejitev.

Prenos: CORVELVA-primerjava-človek-genoma-Priorix-Tetra-in-linija-MRC-5.pdf

Primerjava med človeškim genomom, ki ga vsebuje Priorix Tetra, in celično linijo MRC-5 (standard ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

Prisotnost virusa rdečk je bila dokazana s sekvenciranjem izredno globoke knjižnice sekve RNA (nastalo je približno 260 milijonov Illumina sekvenc). Odkritih je bilo 114 od 260 milijonov sekvenc, kar je 0.00004% celotne sekvence. Zaporedja genoma rdečk so nato ročno potrdili s programsko opremo BLAST (Osnovno orodje za lokalno poravnavo, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Sekvencirana knjižnica na nižji globini (približno 12 milijonov seznamov zaporedja Illumina, kar je 6 milijonov sekvenciranih fragmentov knjižnice) ni zaznala prisotnosti BREZBLJENIH bral, ki jih je mogoče pripisati rdečkam.

Enako ročno so potrdili tudi zaporedja drugih virusov, prisotnih v cepivu (norice, ošpice in mumps), kar potrjuje, da so bili pravilno dodeljeni.

Predstavitev

Sekvenerji nove generacije so postali izbirni instrumenti za poglobljene analize na področju biologije in medicine, še posebej natančne. Ta orodja omogočajo nov in bolj globalen pristop k vrsti aplikacij, kot so novo zaporedje, metagenomija, epigenomika, zaporedje transkriptov in ponovno zaporedje genomov.

Ta zadnja aplikacija (ponovno zaporedje) je na človeškem področju zelo razširjena tako v raziskovalne kot diagnostične namene in je sestavljena iz sekvenciranja s tehnologijo NGS (Next Generation Sequisting) celotnega posameznega genoma, da bi preslikali enotne nukleotidne mutacije (SNP, izgovorjava 'snip') "), vstavitve in izbrisi bolj ali manj dolgih zaporedij so se zgodili na določenih položajih genoma in razlike v številu kopij delov genoma / genov (CNV, različice številk kopij).

Postopek zaporedja zahteva, da se posameznikova DNK mehansko razbije na majhne fragmente (400–500 baznih parov), na drobce pa se privežejo delci umetnih trakta DNA, imenovani adapterji, ki omogočajo, da se fragmenti človeške DNK vežejo na steklena površina, na kateri se nato odčitajo podlage (A, C, G, T). Baze DNK beremo z vključitvijo kemijskih reakcij nukleotidov, označenih s fluorescentnimi molekulami. Milijoni sekvenc (odčitkov), pridobljenih s sekvenciranjem na stekleni površini, se nato preskusijo na človeškem referenčnem genomu z ustrezno programsko opremo in nato se identificirajo vse različice v analiziranem genomu v primerjavi z referenco.

Ta isti postopek je bil izveden na človeškem genomu, ki je prisoten v seriji Priorix Tetra. n. A71CB256A in na DNK, odvzeti iz celične linije MRC-5, deponirano leta 1966 pri ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC je vodilna svetovna organizacija virov in standardov bioloških materialov, katerih poslanstvo se osredotoča na pridobivanje, overjanje, proizvodnjo, skladiščenje, razvoj in distribucijo referenčnih mikroorganizmov, celičnih linij in drugih standardnih bioloških materialov. Ustanovljen je bil leta 1925, ko je odbor znanstvenikov prepoznal potrebo po centralizirani zbirki bioloških materialov, ki bi lahko služila znanstvenikom po vsem svetu.

Celična linija MRC-5 izvira iz običajnega pljučnega tkiva 14-tedenskega moškega ploda in jo je odložil JP Jacobs septembra 1966. Te celice naj bi lahko pred začetkom podvojile 42 do 46 populacije. staranja. Referenčni članek za to celično linijo sega v leto 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0

Rezultati

Kot smo že pokazali, je človeška DNA prisotna v seriji Priorix Tetra. n. A71CB256A (naveden na naslednjih grafih kot vzorec ID12051PT) je celoten posamični genom ali genomska DNK vseh kromosomov moškega posameznika. Grafi pokritosti (srednja globina = povprečna pokritost) 22 človeških kromosomov in kromosomov X in Y so prikazani spodaj, za cepivo (slika zgoraj) in celično linijo MRC5 (slika spodaj).

Rezultati analize različnih vrst variant so prikazani spodaj.

Različice posameznih nukleotidov (SNP) in kratke vstavke / delecije (InDels)

Različice posameznih baz DNK (SNP, izgovorjeno "snip") so polimorfizmi, torej različice genskega materiala, ki jih nosi en sam nukleotid. 'InDels' so majhni vstavki in izbrisi dolžine manj kot 50 bp in predstavljajo drug razred genomskih različic v človeškem genomu.

SNP (enojne nukleotidne variante) - ID12051PT

SNP (enojne nukleotidne variante) - MRC-5

INDEL-ji (majhni vstavki / izbrisi) - ID12051PT

INDEL-ji (majhni vstavki / izbrisi) - MRC-5 

CNV (različice številk za kopiranje) in SV (strukturne različice)

Različice v številu izvodov (CNV) so genomske različice zaradi razlik v številu kopij relativno velikih fragmentov (daljših od 50 bp) med posameznimi genomi. Obstajata dve vrsti CNV: vrsta 'pridobitev' (kopija dobiček) in 'izguba' vrsta (izguba kopij).

Strukturne različice (SV) so genomske različice s sorazmerno velikimi velikostmi (> 50 bp), vključno z izbrisi, podvajanjem, vstavitvami, inverzijami in translokacijami.

CNV (variacije v številu izvodov)

SV (strukturne različice)

Krožna vizualizacija genomov (circos plot)

Spodaj je prikazan grafični prikaz obeh genomov, imenovanih „cirkonska ploskev“.

Pomen različnih koncentričnih krogov

1. Zunanji krog (prvi krog) je število kromosomov.
2. Drugi obroč (modra) predstavlja pokritost odčitkov v slogu histograma. Vsak histogram je povprečna pokritost območja 0,5 Mbp.
3. Tretji obroč (črn) predstavlja gostoto INDEL-ov v slogu 'disperzijskega grafa'. Vsaka črna točka se izračuna kot število INDEL-ov (Majhne vstavke / brisanja) v območju 1 Mbp.
4. Četrti obroč (zelen) predstavlja gostoto snp v 'disperzijskem grafu'. Vsaka zelena pika se izračuna kot število SNP-jev (posamezne nukleotidne variante) v območju 1 Mbp.
5. Peti obroč predstavlja razmerje homozigosti (oranžna) in heterozigotičnosti (siva) SNP v slogu histograma. Vsak histogram se izračuna iz 1 Mbp regije.
6. Šesti obroč predstavlja sklep CNV (Različice v številu izvodov). Rdeča pomeni pridobivanje kosov DNK, zelena pa izgubo.
7. Najbolj osrednji obroč predstavlja sklepanje SV (strukturne variante) v eksoničnih in spajkalnih območjih. MED MED (oranžna, translokacije), INS (zelena, vstavki), DEL (črtanja, siva), DUP (podvajanja, roza) in INV (inverzije, modra).

sklepi

Oba genoma kažeta pomembne razlike. Zlasti se izkaže, da je genom cepiva močno spremenjen v primerjavi s celično linijo, deponirano leta 1966. Treba je povedati, da nismo imeli možnosti zaporedja celične linije, ki jo uporablja GlaxoSmithKline za izdelavo cepiva Priorix Tetra, toda zaloge original. Farmacevtske družbe, ki uporabljajo celične linije za proizvodnjo zdravil in cepiv, imajo svojo linijo MRC-5, vendar to ne spreminja naših sumov, to je dejstvo, da obvladovanje genske stabilnosti občasno ni potrebno in je po našem mnenju zelo resno predvsem zato, ker je dovoljeno biti navzoč brez omejitev.