Končno smo tu - po skoraj dveh letih - izšla je prva strokovno recenzirana publikacija naših analiz, objavljene pa bodo tudi številne druge.

Cilj tega članka je povzeti naslednja vprašanja: kaj je bilo objavljeno, kakšna je njegova veljavnost in zakaj je pomembno za našo preiskavo cepiv. Vsi ti argumenti bodo na prvih straneh obravnavani pogovorno in netehnično, medtem ko bo od tretje strani naprej tehnična študija, ki bo strokovnjakom tega sektorja omogočila, da sami ocenijo članek.

Članek objavljen na temo "F1000 Research"¹ je rezultat začetne študije, ki jo je opravil eden od laboratorijev, ki jih je združenje Corvelva imenovalo za izvajanje analiz. Spomnimo vas - ker je od začetka tega dela minilo več kot dve leti in so se prvi dodali številni rezultati - prvo večje vprašanje, ki smo ga morali raziskati, je bilo nenormalno količino človeške DNK, ki smo jo našli v analiziranih cepivih.

Začetne analize so pokazale, da obe analizirani štirivalentni cepivi MMRV vsebujejo od 1 do 2.7 mikrograma / viale (kot je objavljeno v tem članku), zato smo se odločili, da bomo o takšnih rezultatih poročali javno in takoj, ker preprosto ni bilo pričakovati, da bo takšna količina DNK bi lahko bila prisotna v cepivu.

Poleg ugotovitev študije, ki so strogo tehnične in zato razumljive le tistim, ki delujejo na področju metagenomskih raziskav, je v grafih opaziti, da dva vzorca cepiva vsebujeta visok odstotek odčitkov človeške DNK Poleg tistih, ki jih pričakuje genom virusa norice (virus humanih alfaherpesov 3), je bil v članku predstavljen edini med štirimi, kot analiza DNK seq.

Vendar želimo opozoriti, da so količine DNK, ki jih je našel in potrdil enaka metoda, ki je zdaj potrjena tukaj so bili še višji: do 3.7 mikrogramov na vialo, kar vodi do znatne razlike od serije do serije. Pravzaprav v našem poročilu, objavljenem 22. decembra 2018² poročali so o rezultatih, dobljenih z analizo različnih serij od tistih, ki so bile obravnavane v tem članku, nato pa potrjene z medlaboratorijskimi analizami, ki so še v postopku objave.

V tej publikaciji je zato treba obravnavati največjo pozornost, saj ta potrjuje metodo, ki smo jo uporabili, daje pomembno točko razpravam o "vrsti" izvedenih analiz, in posledično dokončno potrdi vse študije, ki so bile pozneje izvedene z metodo NGS: poglobljena analiza vrste genetskega materiala, prisotnost naključnih virusov, velika odsotnost oslabljenih virusov, ki bi morali biti prisotni, in količine človeške DNK, ki je bila popolnoma pod nadzorom (tudi zato, ker se zelo razlikuje od vzorca do vzorca) , mutantna populacija, fagi, DNK drugih vrst itd. Tu lahko najdete arezultate bomo povzeli na naši spletni strani³. 

 Vse, kar smo v zadnjih letih zanikali, z biološkega vidika in temeljito poroča o rezultatih nadzornim organom, prevzame ustreznejšo znanstveno konotacijo (četudi, ponovimo še enkrat, ni bilo treba opraviti strokovnih pregledov skrbi, vendar so predstavljeni podatki, zelo resni po svoji vsebini in možnih posledicah za zdravje ljudi). Vendar bomo zdaj, ko je objava metode končana, zahtevali odgovore, ki jih še nismo dobili.

Ti rezultati nedvomno potrjujejo prisotnost fetalne DNK v cepivih Priorix tetra v različnih količinah od serije do serije, kar kaže na slab nadzor kakovosti teh farmacevtskih izdelkov.

Prav tako bi radi spomnili na poročilo o celotnem zaporedju genomov MRC-5, objavljeno na spletni strani Corvelva 27. septembra 2019⁴  prikazuje globoko modifikacijo te DNK tudi v genih, povezanih z razvojem tumorskih bolezni (tudi ti podatki bodo kmalu objavljeni). Kontaminacijska fetalna DNK, ki jo v vseh analiziranih vzorcih najdemo v spremenljivih (tj. Nenadzorovanih) količinah, je do 300-krat višja od meje, ki jo je EMA določila za rakotvorno DNA (10 ng / odmerek, kar ustreza DNK, ki jo vsebuje približno 1000 rakavih celic, na podlagi statističnega izračuna, medtem ko je previdnostna meja 100 pg / odmerek), mejo, ki jo je treba nujno uporabiti tudi za fetalno DNA, ki neizogibno onesnažuje cepivo Priorix Tetra.

Zato je treba to cepivo šteti za pomanjkljivo in lahko nevarno za zdravje ljudi, zlasti za pediatrično populacijo, ki je zaradi nezrelosti imunostnih sistemov veliko bolj občutljiva na gensko in avtoimunsko škodo.

 Kot je bilo pričakovano, je naslednji del članka bolj "tehničen" in težko razumljiv za nestrokovnjake, zato smo se odločili, da tudi za namene preglednosti temu dokumentu priložimo tudi "Dosje EMA - Razprava o dosjeju NGS o rezultatih raziskave kakovosti cepiva". Morali smo ekstrapolirati samo tisti del, ki ga je mogoče objaviti, to je 50 strani dokumentacije v primerjavi z 200 stranmi NGS, saj mora večina informacij, ki jih vsebujejo in so registrirani pri regulativnih organih, ostati zaupni. Strogi zakon znanosti narekuje, da je mogoče informacije v reviji objaviti le, če so izvirne in ker imamo v pripravi drugo delo, ga ne želimo ogrožati.

EMA - Razprava o dosjeju NGS o rezultatih raziskave kakovosti cepiva ". - https://bit.ly/342XKi7

Na koncu bi radi, da bi se izognili nesporazumom, iz zgornje publikacije poudarili del „Izjave o financiranju“:

"Metagenomsko zaporedje B1 in B2 je financiralo Corvelva (neprofitno združenje, Veneto, Italija) v skladu s pogodbo o opravljanju storitev z laboratorijem. Noben drug prispevek ni sodeloval pri podpori dela. študija, zbiranje in analiza podatkov, odločitev o objavi ali pripravi rokopisa "

Priloženo:

• Publikacija - Ali me cov? Vpliv zmanjšanja pokritosti na študije zaporedja metagenomskih pušk
• CORVELVA-nit-NGS-EMA-eng
• Prva recenzirana publikacija o cepivih MMRV (Priorix Tetra)

V članku "Ali me cov? Vpliv zmanjšanja pokritosti na študije zaporedja metagenomskih pušk "

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

Avtorja obravnavata tehnično-metodološko vprašanje, ali je za opis kompleksnih bioloških matric mogoče uporabiti masivno vzporeden metagenomski pristop z nizko bralno pokritostjo. Ocene raznolikosti, številčnosti vrst in zmožnosti obnove metagenoma de novo glede na dolžino in popolnost se izračunajo, da bi razumeli, koliko lahko zmanjšanje globine sekvenciranja, ki ga spreminjamo naključno podzmogljive odčitke zaporedja, vpliva na končne rezultate. Rezultati kažejo, da je mogoče indekse raznolikosti zapletenih prokariotskih, evkariontskih in virusnih skupnosti natančno oceniti s 500,000 odčitki ali manj, čeprav za posebej zapletene vzorce lahko zahtevamo 1,000,000 odčitkov. Nasprotno, projekt, ki vključuje rekonstrukcijo metagenoma in njegovih genov vsebuje več kot 1,000,000 odčitkov.

Med raznovrstne in zelo različne med seboj zapletene matrice, ki so bile podvržene obsežni metagenomski analizi, sta bili vključeni dve biološki zdravili, in sicer dve različni seriji živega oslabljenega cepiva MPRV, ki se uporablja za imunizacijo proti ošpicam, mumpsu, rdečkam in noricam pri otrocih. DNK smo odvzeli iz cepiv, gradili smo genomske knjižnice s standardnimi komercialnimi protokoli in množično sekvenciranje je bilo izvedeno s tehnologijo Illumina.

Poleg ugotovitev dela, ki so strogo tehnične in zato razumljive samo tistim, ki raziskujejo na področju metagenomije, je razvidno tudi iz skodelskih grafikonov, ki jih vsebuje "razširjeni podatki" (https://osf.io/wq395/ za vzorca B1 in B2) je, da je bilo ugotovljeno, da dva vzorca cepiva vsebujeta velik odstotek odčitkov človeške DNK poleg tistih, ki jih pričakuje genom virusa norice (človeka alfaherpe virusi 3), edinega zaznati med štirimi, saj je bila v članku predstavljena analiza tipa DNA-seq.

71% odčitkov v eni seriji in 88% v drugi so človeškega izvora, predvidoma izhajajo iz plodove celične linije MRC-5 (ne pozabite, da je poznejša analiza potrdila, da je linija MRC5), v kateri živijo oslabljeni virusi rdečk in norice. gojene med pripravo cepiva. Še več, kot se je zgodilo v različnih serijah istega cepiva MPRV, ki ga je Corvelva testirala med letoma 2017 in 2019, je količina odvzete DNK vrstnega reda mikrograma.

V serijah cepiva, preskušenih z istimi protokoli in tehnologijo, o katerih so poročali v materialih in metodah članka, so bile odkrite količine od 1 do skoraj 3 mikrograme na vialo, količine pa so med seboj različne, vendar vedno pomembne.

B1 https://osf.io/86mbn/

B2 https://osf.io/dxayz/

V poročilu, ki ga je Corvelva objavila 22.12.2018 ⁵Za nadaljnje serije, analizirane po tistih, ki so bili obravnavani v članku, so bili pozvani naslednji rezultati, ki so jih kasneje potrdili z medlaboratorijskimi analizami, ki so še v postopku objave.

Priorix Tetra veliko. A71CB205A (junij 2018) - analiza DNK

Priorix Tetra veliko. A71CB256A (december 2018) –DNA analiza

DNK analiza

Merjenje koncentracije DNK s fluorometrom QuBit je pokazalo, da serija A71CB205A vsebuje skupno 1.7 µg gDNA na odmerek 0.5 ml, izračunano na naslednji način: 9.41ng / µl (koncentracija določena pri QuBit) x 45 (končna resuspenzijska količina DNK po ekstrakciji, izražena v mikrometrih) x 4 (začetni volumen, predložen postopku ekstrakcije, je volume prostornine odmerka, vsebovane v celotni viali 0.5 ml).

Merjenje DNA koncentracija s QuBit fluorometrom je pokazala, da A71CB256A veliko vsebuje skupno gDNA 3.7 µg na odmerek 0.5 ml, izračunano na naslednji način: 40.8 ng / µl (koncentracija določena pri QuBit) x 55 (končni resuspenzijski volumen DNK po ekstrakciji, izražen v mikrometrih) x 5/3 (začetni volumen, predložen postopku ekstrakcije, je 300 μl na 500 μl suspenzije ).

Človeški DNK, ki ga najdemo v tej seriji, je približno 8 do 1 glede na DNA norice (glejte naslednje rezultate razvrstitve fragmentov sekve DNA, ki kažejo, da je 88% celotnih sekvenciranih fragmentov DNK človeškega izvora in 11% genoma virusa norice).

Glede na to, da je NGS kvantitativna tehnologija, fluorimetrična kvantifikacija celotne DNK, odvzete iz cepiva (npr. Serija A71CB256A = 3.7 mikrogramov na odmerek), v kombinaciji z upoštevanjem zgoraj navedenega relativnega količinskega merjenja (8: 1) omogoča, da rečemo, da je človek DNK lahko znaša približno 2.9 mikrogramov na odmerek, v primerjavi s približno 740 nanogrami DNK norice. Verjetno je tudi to vsaj en del DNK z visoko molekulsko maso, ki ga vidimo na gelu, je lahko človeška DNA z visoko molekulsko maso.

RNA analiza

Količina RNA vključeno v vialo s cepivom veliko A71CB256A se je izkazalo za približno 200ng.

RIN, enak 8, označuje an odlične kakovosti RNA in nepoškodovana evkariontska RNA, saj sta prisotna vrhova 18S in 28S, značilna za evkariontsko RNA.

Odgovori na naša vprašanja, ki smo jih sčasoma posredovali regulativnim agencijam, so izredno pomembni. Agencije trenutno še niso odgovorile na vprašanja v zvezi z rezultati popolnih analiz, poslanih EMA in AIFA.

Izvleček iz odgovora EMA na naše vprašanje glede varnosti ostankov MRC-5 v cepivu Priorix® tetra (EMA zahteva, referenca ask-43967, 3. avgust 2018) - "Na podlagi objavljenih informacij vsebuje zdravilo Priorix® Tetra virusne seve, ki se proizvajajo ločeno v celicah piščančjih zarodkov (mumps in ošpice) ali v človeških diploidnih celicah MRC-5 (rdečkam in piščančji pox). Celične linije, ki se uporabljajo za Priorix® Tetra, vključujejo človeške diploidne celične linije, ki se ne morejo nenehno deliti. Upoštevajte, da v skladu z Evropsko farmakopejo dr. MRC-5 diploidnih celičnih linij ni tumorigensko, kar dokazujejo desetletja uporabe in nadzora, zato najvišja meja DNK celic MRC-5 ne velja. "

Tako kot danes ni bilo predloženih nobenih dokazov (niti v zvezi s certifikati o kakovosti izdelka niti referenčno znanstveno literaturo za EMA) teh kontrol, ki bi zagotovili, da ni primerno uporabiti najvišje mejne vrednosti.

V smernici FDA "Smernice za industrijo: karakterizacija in kvalifikacija celičnih substratov in drugih bioloških materialov, ki se uporabljajo pri proizvodnji virusnih cepiv za indikacije nalezljivih bolezni"⁶ je navedeno, da:

• sev diploidnih celic mora vedno ostati diploiden. Če te lastnosti niso stabilne, je treba dokazati, da nestabilnost ne vpliva negativno na proizvodnjo ali skladnost izdelka.
• za široko uporabljene človeške diploidne celične seve, kot so celice MRC-5 in WI-38, merjenje preostale DNK morda ni potrebno, ker za ostanke DNK teh človeških diploidnih celic ne smatramo varnosti
• ostanke DNK je treba omejiti za neumigenske neprekinjene celice, na primer TRUE celice z majhnim številom prehodov, manj kot 10 ng / odmerek za parenteralno inokulacijo, kot priporoča WHO

In smernica Svetovne zdravstvene organizacije "Priloga 3 - Priporočila za vrednotenje živalskih celičnih kultur kot substratov za proizvodnjo bioloških zdravil in za karakterizacijo celičnih bank. Nadomestitev Priloge 1 k tehničnim poročilom SZO, n. 878 "doda: (...) nabralo se je veliko izkušenj s citogenetiko WI-38 in MRC-5 od šestdesetih let prejšnjega stoletja in v podporo tej izkušnji so navedeni naslednji članki:

• Jacobs JP. Posodobljeni rezultati o kariologiji celic WI-38, MRC-5 in MRC-9. Razvoj biološke standardizacije, 1976, 37: 155–156.
• Jacobs JP. et al. Smernice za sprejemljivost, upravljanje in testiranje serijsko razmnoženih človeških diploidnih celic za proizvodnjo živih virusnih cepiv za uporabo pri človeku. Journal of Biological Standardization, 1981, 9: 331–342.
• Petricciani JC in sod. Kariološki standardi za rezus diploidno celično linijo DBS-FRhL-2. Časopis za biološko standardizacijo, 1976, 4: 43–49.
• Schollmayer et al. Analiza visoke ločljivosti in diferencialna kondenzacija v človeških kromosomih, vezanih na RBA. Human Genetics, 1981, 59: 187–193.
• Rønne M. Priprava kromosomskih tehnik in tehnike ločevanja z visoko ločljivostjo: pregled. Journal of Dairy Science, 1989, 72: 1363–1377.

Jasno je mogoče opaziti, da je referenčna literatura, ki trdi, da so diploidne celice, ki se uporabljajo za proizvodnjo cepiv, varne z vidika genske stabilnosti, je zastarela. Že pred 40 leti so bile ugotovljene prve genetske anomalije, za katere velja varnost za cepiva zanemarljiva, in glede na to, kar poročajo v smernicah Svetovne zdravstvene organizacije, od takrat niso bile posodobljene nove tehnologije zaporedja, zlasti pri NGS, kar je še več gospodarna in hitra, s posledico, da je pri cepivih, ki se uporabljajo agencije že desetletja dovoljujejo prisotnost vedno bolj progresivno gensko spremenjene DNK in v nenadzorovanih količinah. Na to temo glejte poročilo o zaporedju celotnega genoma MRC-5, objavljeno na spletni strani Corvelva dne 27.09.2019, v katerem je globoka sprememba te DNK razvidna tudi v genih, povezanih z razvojem tumorskih patologij. (podatki so objavljeni)

Spodaj je predstavljen izvleček iz pisma dr. T. Deisherja - svetovnega strokovnjaka za uporabo matičnih celic za terapevtske namene in gensko terapijo -, ki izpostavlja zaskrbljenost zaradi tveganj, povezanih z uporabo cepiv, onesnaženih z ostanki človeških plodov. :

Dr. T. DEISHER (pismo guvernerjem - 8. april 2019) - (...) injiciranje naših otrok s človekovo plodno kontaminacijo DNK lahko povzroči dve konsolidirani patologiji:

• vstavitvena mutageneza: DNK človeškega ploda je vgrajen v otrokovo DNK, ki povzroča mutacije. Genska terapija z uporabo rekombinacije majhnih fragmentov z majhnimi fragmenti je pokazala, da pri manj kot 1.9 ng / ml fragmentov DNK v 100% injiciranih miši vstavijo matične celice v genom. Ravni fragmentov DNK človeškega ploda pri naših otrocih po cepljenju s cepivi MMR, VARIVAX (piščančja struga) ali hepatitis A dosežejo vrednost nad 1.9 ng / ml.
• avtoimunska bolezen: fetalna človeška DNK spodbuja reakcijo imunskega sistema, da napade telo otroka.

Naši rezultati močno krepijo eksperimentalna opazovanja dr. Deisherja, predvsem dejstvo, da je kontaminacijska fetalna DNK prisotna v vseh vzorcih, analiziranih v različnih količinah (torej nenadzorovanih) do 300-krat višja od meje, ki jo je za rakotvorno DNA določila EMA (10 ng / odmerek, kar ustreza DNK, vsebovani v približno 1000 rakavih celicah, dobljeni na podlagi statističnega izračuna, medtem ko je previdnostna meja 100 pg / odmerek), ki jo je treba uporabiti tudi za plodovo DNK, ki neizogibno kontaminira Priorix® Tetra.

Zato je treba to cepivo šteti za pomanjkljivo in lahko nevarno za zdravje ljudi, zlasti pri otroški populaciji, ki je zaradi nezrelosti v sistemih popravil veliko bolj občutljiva na gensko in avtoimunsko škodo.

1. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
2. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate.html
   https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate-en.html
3. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/
5. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
6. https://www.federalregister.gov/documents/2010/03/04/2010-4553/guidance-for-industry-characterization-and-qualification-of-cell-substrates-and-other-biological