Končno smo tam, po skoraj dveh letih izide prva publikacija medsebojnega strokovnega pregleda naših analiz in številne druge bodo sledile.

Tu poskušamo na teh prvih straneh povzeti na zelo diskurzen in netehničen način: kaj je bilo objavljeno, kakšno veljavnost ima in zakaj je pomembno za našo preiskavo cepiv. 

(Po drugi strani so strani od 3 do XNUMX namenjene tehnični študiji, ocena članka pa prepušča tistim, ki delajo v sektorju)

Kaj je objavljeno v "F1000 Research" ¹ je rezultat začetnega dela dela, ki ga je v imenu združenja Corvelva opravil eden od laboratorijev, zadolžen za analize. Spomnimo - ker je od začetka tega dela minilo več kot dve leti in so bili prvotnim rezultatom dodani številni drugi rezultati - prvo večje vprašanje, ki smo ga morali raziskati, je bilo nenormalno količino človeške DNK, ki smo jo našli v analiziranih cepivih. 

V obeh analiziranih štirivalentnih cepivih MPRV so bile prvotno najdene količine od 1 do 2,7 mikrogramov / viala (glede na zadevno publikacijo), kar nas je vodilo k javnemu in takoj poročanju o tem rezultatu, ker preprosto ni bilo pričakovati, da bo ta količina DNK je bila prisotna v cepivu.

Razen ugotovitev in zaključkov, do katerih je delo doseglo, ki so strogo tehnični in zato razumljivi samo tistim, ki izvajajo raziskave na področju metagenomije, je v grafih opaziti, da je bilo ugotovljeno, da dva vzorca cepiva vsebujeta visok odstotek odčitke človeške DNK poleg tistih, ki jih pričakuje genom virusa norice (človeški virus alfaherpes 3), od štirih le zaznaven, kot je bila v članku predstavljena analiza DNA-seq.
Vendar bi radi poudarili, da so kasneje količine DNK, najdene in potrjene z istimi metoda, ki je zdaj potrjena tukaj so bile še višje: do 3,7 mikrogramov na vialo, kar je povzročilo znatno razliko med serijo in serijo.
Pravzaprav v našem poročilu, razkritem dne 22.12.2018 ² poročali so o rezultatih nadaljnji sklopi, analizirani po obravnavi v članku, ki ga nato še potrdijo medlaboratorijske analize, ki se še objavljajo. 

Zato nas pri tej publikaciji najbolj zanima to, da potrjuje uporabljeno metodo, daje pomembno točko razpravam o "vrsti" opravljenih analiz in posledično odločno potrdi vse opravljeno delo z metodo NGS: vpogled v vrsto genetskega materiala, prisotnost naključnih virusov, velika odsotnost oslabljenih virusov, ki naj bi bili namesto tega prisotni, in količina namesto pod nadzorom (tudi zato, ker se od vzorca do vzorca zelo razlikuje) prisotne človeške DNK, mutantne populacije , fage, DNK drugih vrst in postopoma so vsi rezultati, ki jih najdete, povzeti na našem spletnem mestu. ³

Vse, kar smo z vidika biološke vsebine v zadnjih letih obsojali, suženjsko poročanje rezultatov nadzornim organom, dobi ustreznejšo znanstveno konotacijo (četudi, če še enkrat ponovimo, niso bile medsebojne ocene tiste, ki bi morale skrbeti vendar predstavljeni podatki zelo resni po svoji vsebini in možnih posledicah za zdravje ljudi). Po objavi metode pa bomo zahtevali odgovore, ki še niso prispeli.

Ti rezultati dokončno potrjujejo prisotnost fetalne DNK v cepivih Priorix tetra v količinah, ki se razlikujejo med različnimi serijami, kar kaže na slabši nadzor teh farmacevtskih izdelkov. 

Spomnimo se tudi poročila o zaporedju celotnega genoma MRC-5, objavljenega na spletni strani Corvelva dne 27.09.2019 ⁴ pri čemer je globoka sprememba te DNK očitna tudi v genih, povezanih z razvojem tumorskih patologij (drugi podatki se objavljajo).

Kontaminacijska fetalna DNK, prisotna v vseh analiziranih vzorcih v spremenljivih količinah (torej nekontrolirano), je do 300-krat višja od meje, ki jo je določila EMA za rakotvorno DNK (10 ng / odmerek, kar ustreza DNK, vsebovani v približno 1000 rakavih celicah, dobljeno na podlagi statističnega izračuna, medtem ko je previdnostna meja 100 pg / odmerek), ki jo je treba uporabiti tudi za plodovo DNK, ki neizogibno kontaminira zdravilo Priorix Tetra.

Iz tega sledi, da je treba to cepivo šteti za pomanjkljivo in lahko nevarno za zdravje ljudi, zlasti za pediatrično populacijo, ki je zaradi nezrelosti v zavetiščih zelo občutljiva na gensko in avtoimunsko škodo.

Kot je bilo pričakovano, je naslednje nestrokovnejše in bolj težko razumljivo, zato smo se tudi zaradi preglednosti odločili, da temu dokumentu pripišemo tudi "Razprava o dosjeju EMA - NGS o rezultatih, dobljenih v raziskavi kakovosti cepiva". Razkritega dela smo morali le ekstrapolirati, več kot 50 strani dosjejev v primerjavi z 200 NGS, ker mora večina informacij, ki jih vsebujejo in so registrirani pri regulativnih organih, ostati zaupni. Strog zakon o znanosti zahteva, da se podatki objavijo v reviji le, če so neobjavljeni, mi pa, če imamo v pripravi več drugih objav, jih ne želimo ogrožati.

 Za konec, da se izognemo nesporazumom, želimo iz objave omeniti del "Izjave o financiranju": 

"Metagenomsko zaporedje B1 in B2 je financiralo podjetje Corvelva (neprofitno združenje, Benečija, Italija), v okviru pogodbe o opravljanju storitev z laboratorijem. Pri podpori delu ni bil vključen noben drug prispevek. Finančniki niso imeli nobene vloge pri načrtovanju študije, pri zbiranju in analiziranju podatkov, pri odločitvi o objavi ali pripravi rokopisa. "

---

Priponke:

• Publikacija - Ali me cov? Vpliv zmanjšanja pokritosti na študije zaporedja metagenomskih pušk
• CORVELVA-nit-NGS-EMA-ita
• PDF - Objava prve strokovne ocene o cepivih MPRV (Priorix Tetra)

V članku "Ali me cov? Vpliv zmanjšanja pokritosti na študije zaporedja metagenomskih pušk "

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

Avtorji se lotevajo tehnično-metodološkega vprašanja, ali je mogoče za opredelitev zapletenih bioloških matrik uporabiti masiven vzporeden pristop metagenomike z nizko bralno pokritostjo. Izračunajo se ocene raznolikosti, številčnosti vrst in zmožnosti rekonstrukcije de novo metagenoma glede na dolžino in popolnost, da bi razumeli, koliko lahko zmanjšanje globine sekvenciranja, ki se spreminja z naključnim vzorčenjem zaporedja, prebere. Rezultati kažejo, da je mogoče indekse raznolikosti prokariontskih, evkariontskih in virusnih kompleksnih skupnosti natančno oceniti s 500.000 odčitki ali manj, čeprav lahko zapleteni vzorci zahtevajo 1.000.000 odčitkov. Nasprotno pa projekt, ki vključuje rekonstrukcijo metagenoma in genov, ki jih vsebuje, zahteva več kot 1.000.000 odčitkov.

Med različne in zelo različne kompleksne matrice, ki so bile podvržene obsežni metagenomski analizi, sta bili vključeni dve biološki zdravili, to je dve različni seriji živega oslabljenega cepiva MPRV, ki se uporablja za imunizacijo proti ošpicam, mumpsu, rdečkam in piščančji pox pri otrocih. DNK smo odvzeli iz cepiv, gradili smo genomske knjižnice po standardnih komercialnih protokolih in izvedli so množično zaporedje s tehnologijo Illumina.

Razen premislekov in zaključkov, do katerih je delo doseglo, ki so strogo tehnični in zato razumljivi samo tistim, ki raziskujejo na področju metagenomije, je razvidno tudi iz skodnih grafov, ki jih vsebuje "razširjeni podatki" (https://osf.io/wq395/ vzorca B1 in B2) je, da je bilo ugotovljeno, da dva vzorca cepiva vsebujeta velik odstotek odčitkov človeške DNK, poleg pričakovanih v genomu virusa noric (Human alphaherpes virus 3), ki je bil edini od štirih zaznavnih v članku predstavljena je bila analiza tipa DNA-seq. 

71% odčitkov v eni seriji in 88% v drugi je človeškega izvora, predvidoma izhaja iz celične linije ploda MRC-5 (ne pozabite, da so poznejše analize potrdile, da je linija MRC5), pri katerih med pripravo cepiva gojijo žive oslabljene viruse rdečk in požiralcev. Poleg tega, kot se je zgodilo na različnih serijah istega cepiva MPRV, ki ga je Corvelva testirala med letoma 2017 in 2019, je količina odvzete DNK vrstnega reda mikrograma. 

V serijah cepiva, testiranih z istimi protokoli in tehnologijo, o katerih so poročali v materialih in metodah članka, so bile odkrite količine med 1 in skoraj 3 mikrogrami na vialo, količine pa se razlikujejo med eno serijo in drugo, vendar vedno pomembne

B1 https://osf.io/86mbn/

B2 https://osf.io/dxayz/

V poročilu, ki ga je Corvelva razkrila 22.12.2018, so bili navedeni naslednji rezultati nadaljnji sklopi, analizirani po obravnavi v članku, nato nadalje potrjeno z medlaboratorijsko analizo, ki je še vedno objavljena: 

Priorix Tetra veliko. A71CB205A (junij 2018) - analiza DNK

Priorix Tetra veliko. A71CB256A (december 2018) - analiza DNK

DNK analiza

Merjenje koncentracije DNA s fluorimetrom QuBit je pokazal, da serija A71CB205A vsebuje količino 1.7 µg gDNA vsota na 0.5 ml odmerka, izračunano na naslednji način: 9.41ng / µl (koncentracija, določena pri QuBit) x 45 (končna resuspenzijska količina DNK po ekstrakciji, izražena v mikrometrih) x 4 (začetni volumen, podvržen postopku ekstrakcije, je ¼ volumen odmerka v celotni viali je enak 0.5 ml).

Merjenje koncentracije DNA s fluorimetrom QuBit je pokazal, da serija A71CB256A vsebuje količino gDNA 3.7 µg skupaj na odmerek 0.5 ml, izračunano na naslednji način: 40.8 ng / µl (koncentracija določena pri QuBit) x 55 (končni volumen resuspenzije DNK po ekstrakciji, izražen v mikrometrih) x 5/3 (začetni volumen, ki je bil podvržen postopku ekstrakcije, je 300 µl od 500 μl suspenzije).

Človeški DNK, ki ga najdemo v tej seriji, ima sorazmerno razmerje približno 8 do 1 v primerjavi z DNK norice (glejte naslednje rezultate razvrščanja fragmentov DNK-sek, v katerih je razvidno, da je 88% vseh sekvenciranih fragmentov DNK človeškega izvora in 11% je genoma virusa noric). Glede na to, da je NGS kvantitativna tehnologija, nam omogoča fluorimetrična kvantifikacija celotne DNK, odvzete iz cepiva (npr. Serija A71CB256A = 3,7 mikrogramov na odmerek), povezana z upoštevanjem zgoraj navedenega relativnega količinskega merjenja (8: 1). reči, da je človeška DNK lahko naokoli 2,9 mikrogramov na odmerek, v primerjavi s približno 740 nanogrami DNK norice. Verjetno je tudi to vsaj del DNK z visoko molekulsko maso, ki ga vidimo na gelu, je lahko človeška DNA z visoko molekulsko maso.

RNA analiza

Znesek RNA V viali cepiva serije A71CB256A je bilo približno 200ng.

RIN, enak 8, označuje izjemno kakovostno RNA in nedotaknjeno evkariontsko RNA, saj sta prisotna tako vrha 18S kot 28S, značilna za evkariontsko RNA.

Odgovori na naša vprašanja, ki smo jih čez čas poslali regulativnim agencijam, so zelo pomembni. Trenutno agencije še niso odgovorile na vprašanja v zvezi z rezultati celotnih analiz, dostavljenih EMA in AIFA.

Izvleček iz ema odgovora na naše vprašanje v zvezi z varnostjo ostankov mrc-5 v cepivu priorix tetra (zahteva EMA referenca ask-43967, 3. avgust 2018) - „Na podlagi objavljenih informacij vsebuje zdravilo Priorix Tetra virusne seve, ki se proizvajajo ločeno v celicah piščančjih zarodkov (mumps in ošpice) ali v človeških diploidnih celicah MRC-5 (rdečkam in piščančji pox). Celične linije, ki se uporabljajo za zdravilo Priorix Tetra, vključujejo človeške diploidne celične linije, ki se ne morejo nenehno deliti. Upoštevajte, da v skladu z Evropsko farmakopejo MRC-5 diploidne celične linije niso tumorigenske, kar dokazujejo desetletja uporabe in nadzora, zato najvišja meja DNK celic MRC-5 ne velja. "

Do danes ni bilo predloženih nobenih dokazov (niti v zvezi s certifikati o kakovosti izdelka niti znanstveno referenčno literaturo za EMA) teh kontrol, ki bi zagotovili, da je primerno ne uporabljati najvišje mejne vrednosti.

V smernici FDA "Smernice za industrijo: karakterizacija in kvalifikacija celičnih substratov in drugih bioloških materialov, ki se uporabljajo pri proizvodnji virusnih cepiv za indikacije nalezljivih bolezni" ⁶ poroča se, da:

• sev diploidnih celic mora vedno ostati diploiden. Če te lastnosti niso stabilne, je treba dokazati, da nestabilnost ne vpliva negativno na proizvodnjo ali skladnost izdelka.
• za široko uporabljene človeške diploidne celične seve, na primer celice MRC-5 in WI-38, merjenje preostale DNK morda ni potrebno, ker za ostanke DNK teh človeških diploidnih celic ne smatramo varnosti  
• za ne-tumenske neprekinjene celice, kot so celice z nizkimi prehodnimi VERO, je treba omejiti preostalo DNK, manjše od 10 ng / odmerek za parenteralno inokulacijo, kot priporoča WHO

In v smernici Svetovne zdravstvene organizacije "Priloga 3 - Priporočila za vrednotenje živalskih celičnih kultur kot substratov za proizvodnjo bioloških zdravil in za karakterizacijo celičnih bank. Nadomestitev Priloge 1 k tehničnim poročilom SZO, n. 878 " ⁷ dodamo: (...) na področju citogenetike WI-38 in MRC-5 se je nabralo veliko izkušenj od šestdesetih let prejšnjega stoletja

in v podporo tej izkušnji so navedeni naslednji članki:

• Jacobs JP. Posodobljeni rezultati o kariologiji celic WI-38, MRC-5 in MRC-9. Razvoj biološke standardizacije, 1976, 37: 155–156.
• Jacobs JP. et al. Smernice za sprejemljivost, upravljanje in testiranje serijsko razmnoženih človeških diploidnih celic za proizvodnjo živih virusnih cepiv za uporabo pri človeku. Journal of Biological Standardization, 1981, 9: 331–342.
• Petricciani JC in sod. Kariološki standardi za rezus diploidno celično linijo DBS-FRhL-2. Časopis za biološko standardizacijo, 1976, 4: 43–49.
• Schollmayer et al. Analiza visoke ločljivosti in diferencialna kondenzacija v človeških kromosomih, vezanih na RBA. Human Genetics, 1981, 59: 187–193.
• Rønne M. Priprava kromosomskih tehnik in tehnike ločevanja z visoko ločljivostjo: pregled. Journal of Dairy Science, 1989, 72: 1363–1377.

Jasno je mogoče opaziti, da je referenčna literatura za trditev, da so diploidne celice, ki se uporabljajo za proizvodnjo cepiv, varne z vidika genske stabilnosti, je zastarela. Že pred 40 leti so odkrili prve genske anomalije, ki so veljale za zanemarljive za varnost cepiv, in glede na to, kar poročajo v smernicah Svetovne zdravstvene organizacije, od takrat niso bile posodobljene nove tehnologije zaporedja, zlasti pri NGS, ki je poleg tega ekonomska in hitro, kar ima za posledico cepiva, ki jih dajemo desetletja so agencije dovolile prisotnost vedno bolj progresivno gensko spremenjene DNK v nenadzorovanih količinah. V zvezi s tem glej poročilo o zaporedju celotnega genoma MRC-5, objavljeno na spletni strani Corvelva dne 27.09.2019. ⁸ pri čemer je globoka sprememba te DNK očitna tudi v genih, povezanih z razvojem tumorskih patologij. (podatki so objavljeni)

Objavljen je izvleček iz pisma dr. T. Deisherja, svetovnega strokovnjaka za uporabo matičnih celic v terapevtske namene in gensko terapijo, ki poudarja zaskrbljenost zaradi tveganj, povezanih z uporabo cepiv, onesnaženih z ostanki. človeških plodovih celic: 

Dr. T. DEISHER (pismo vladarjem - 8. april 2019) ⁹ - (...) injiciranje naših otrok s človekovo plodno kontaminacijo DNK lahko povzroči dve uveljavljeni bolezni:

• vstavitvena mutageneza: človeški plodovski DNK je vgrajen v otrokovo DNK, ki povzroča mutacije. Genska terapija z uporabo homologne rekombinacije majhnih fragmentov je pokazala, da pri manj kot 1,9 ng / ml fragmentov DNK v 100% vbrizganih miši vstavijo matične celice v genom. Ravni fragmentov DNK človeškega ploda pri naših otrocih po cepljenju s cepivi MMR, VARIVAX (piščančja struga) ali hepatitis A dosežejo vrednost nad 1,9 ng / ml.
• avtoimunska bolezen: fetalni človeški DNK spodbuja reakcijo imunskega sistema, da napade telo otroka.

Naši rezultati močno okrepijo eksperimentalna opazovanja dr. Deisherja in predvsem dejstvo, da je onesnažujoča fetalna DNA, ki je prisotna v vseh analiziranih vzorcih v spremenljivih (torej nekontroliranih) količinah, do 300-kratnik meje EMA za rakotvorno DNK (10 ng / odmerek, kar ustreza DNK, vsebovani v približno 1000 rakavih celicah, dobljeni na podlagi statističnega izračuna, previdnostna meja pa 100 pg / odmerek), ki jo je treba uporabiti tudi za plodovo DNK, ki neizogibno kontaminira zdravilo Priorix Tetra.

Iz tega sledi, da je treba to cepivo šteti za pomanjkljivo in lahko nevarno za zdravje ljudi, zlasti za pediatrično populacijo, ki je zaradi nezrelosti v zavetiščih zelo občutljiva na gensko in avtoimunsko škodo.

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/
2. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
3. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate.html
   https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate-en.html
4. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
5. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
6. https://www.federalregister.gov/documents/2010/03/04/2010-4553/guidance-for-industry-characterization-and-qualification-of-cell-substrates-and-other-biological
7. https://www.who.int/biologicals/vaccines/TRS_978_Annex_3.pdf
8. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
9. https://www.corvelva.it/approfondimenti/notizie/mondo/lettera-aperta-ai-legislatori-sul-dna-fetale-nei-vaccini-theresa-deisher.html