Priorix Tetra الجينوم البشري وخط خلايا MRC-5 - دراسة مقارنة

Priorix Tetra الجينوم البشري وخط خلايا MRC-5 - دراسة مقارنة

عرض قصير للنتائج

نقدم اليوم دراسة متعمقة إضافية ومهمة جدًا حول التسلسل الجينومي لخط الخلية الذي وجدناه في لقاح MPRV رباعي التكافؤ (الحصبة والحصبة الألمانية والنكاف وجدري الماء) Priorix Tetra® ، وخط خلايا MRC-5 ( المعلن عنها في تطوير اللقاح نفسه).

تلخيص التقارير المنشورة السابقة:

  1. أولاً ، أظهرنا أن كمية الحمض النووي الموجودة في اللقاح المذكور أعلاه أعلى بكثير من العتبة المسموح بها ؛
  2. ثانيًا ، تحققنا من أن خط الخلية هو في الواقع MRC-5 المعلن ؛ 2
  3. أخيرًا ، قمنا بتنفيذ تسلسل جينوم خط الخلية المستخرج مباشرة من اللقاح ، مسلطًا الضوء على الطفرات الرئيسية التي تفتح على إمكانية حدوث مخاطر صحية خطيرة في استخدام هذا اللقاح.

ما نقدمه هنا هو بالتحديد عمل مقارن بين الجينومين: الذي وجدناه بالفعل داخل اللقاح والآخر الذي تم شراؤه من بنك خط الخلايا الدولي باسم MRC-5.

والنتيجة أن الخطين يظهران اختلافات مهمة من وجهة نظر الاستقرار الجيني. على وجه الخصوص ، تم تعديل جينوم اللقاح بشكل كبير مقارنة بخط الخلية المسجل في عام 1966.

وهذا يعني أن المنتجين ، في هذه الحالة لـ Priorix Tetra® ، قد اشتروا خط الخلية في ظل الظروف المثلى من وجهة نظر الاستقرار الجيني ، وبواسطة الاستخدام المستمر بمرور الوقت لأغراض الإنتاج ، قاموا بتسويق اللقاحات التي تحتوي بشكل تدريجي على المزيد والمزيد المواد الوراثية البشرية المعدلة ، وهو أمر خطير على صحة اللقاحات أنفسهم.

نظرًا لأن الوكالات التنظيمية لا تتطلب مراقبة دورية للاستقرار الجيني لخطوط الجنين ولا تحدد حتى الحد الأدنى من الأمان ، يمكننا أن نستنتج أنه لم يتم تلبية المتطلبات الأساسية لجودة وسلامة اللقاحات التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا البشرية من أجل بعض الوقت الآن ، وبالتحديد الحاجة إلى التحقق من أنها لا تطور طفرات خطيرة وإعادة ترتيب وضمان التخلص من معالجة مخلفات المواد الوراثية ، إن وجدت.

ليس من مسؤوليتنا تحديد أي جزء من عملية الإنتاج أو الحفظ يمكن أن يؤثر على جودة المنتج وسلامته ، ولكن ما يمكننا تأكيده اليوم ، من خلال نشر هذا التقرير ، هو الحاجة الملحة لإجراء فحص متعمق لنتائج تحليلاتنا. لقد تم إعلامنا في العامين الماضيين ، مع التركيز على المنتج النهائي ، وبيعه وإدارته وليس فقط على "المكونات" المعتمدة الوحيدة.

نود أن نذكر مرة أخرى أن هذه المنتجات هي جزء من جدول التطعيم الإيطالي وهي مفوضة حاليًا للأطفال الأطفال في بلدنا وكذلك في البلدان الأوروبية الأخرى وبشكل عام في جميع أنحاء العالم.

تتحمل الهيئات التنظيمية مسؤولية كبيرة فيما يتعلق بالسلامة ، والتي يتم وضعها حاليًا في كلمات ، ولكن ، في الممارسة العملية ، وبقدر ما تظهر تحليلاتنا ، لا يمكن ضمانها وهي في الواقع غير مضمونة.


عرض دائري للجينوم (مؤامرة السيرك)

يظهر تمثيل رسومي للجينومين المسمى "مخطط السيرك" أدناه.

كورفيلفا mrc5 1

شرح مختلف الدوائر المتحدة المركز

  1. الدائرة الخارجية (الدائرة الأولى) هي رقم الكروموسوم.
  2. تمثل الحلقة الثانية (الزرقاء) تغطية لقراءات نمط الرسم البياني. كل رسم بياني هو متوسط ​​تغطية مساحة 0.5 ميجا بت.
  3. تمثل الحلقة الثالثة (أسود) كثافة INDELs في نمط "الرسم البياني للتشتت". يتم حساب كل نقطة سوداء على أنها عدد INDELs (عمليات الإدراج / الحذف الصغيرة) في نطاق 1 ميجا بت.
  4. تمثل الحلقة الرابعة (الخضراء) كثافة snp في نمط "الرسم البياني للتشتت". يتم حساب كل نقطة خضراء على أنها عدد SNPs (متغيرات النوكليوتيدات المفردة) في نطاق 1 ميجا بت.
  5. تمثل الحلقة الخامسة نسبة SNPs في نمط الزيجوت المثلي (البرتقالي) والأشكال المتغايرة (الرمادي). يتم حساب كل رسم بياني من منطقة 1 ميجا بت.
  6. الحلقة السادسة تمثل استنتاج CNV (المتغيرات في عدد النسخ). الأحمر يعني اكتساب قطع الحمض النووي والخضار يعني الخسارة.
  7. تمثل الحلقة الأكثر مركزية استدلال SV (المتغيرات الهيكلية) في المناطق السداسية والتضفير. TRA (برتقالي ، انتقالات) ، INS (أخضر ، إدخالات) ، DEL (حذف ، رمادي) ، DUP (مضاعفات ، وردي) و INV (انقلابات ، أزرق).

النتيجة

يظهر الجينومان اختلافات مهمة. على وجه الخصوص ، يبدو أن جينوم اللقاح يتحور بشكل خطير مقارنة بخط الخلية المودع في عام 1966. يجب أن يقال أنه لم يكن لدينا إمكانية تسلسل خط الخلية الذي تستخدمه GlaxoSmithKline لإنتاج لقاح Priorix Tetra® ، ولكن أحد الأسهم الأصلية.

شركات الأدوية التي تستخدم خطوط الخلايا لإنتاج الأدوية واللقاحات لها خط MRC-5 الخاص بها ، ولكن هذه الحقيقة لا تغير شكنا ، أي أنه لا يوجد طلب دوري لمراقبة الاستقرار الجيني ، وهذه مشكلة رئيسية في موقعنا عرض ، خاصة لأن هذا مسموح به بدون حد عتبة.


تنزيل: CORVELVA-Priorix-تترا البشرية الجينوم و-MRC-5-خلية line.pdf


الجينوم البشري لـ Priorix Tetra® وخط خلايا MRC-5 - دراسة مقارنة (معيار ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

تم إثبات وجود فيروس الحصبة الألمانية عن طريق تسلسل مكتبة RNA-seq بعمق مرتفع للغاية (حوالي 260 مليون تسلسل أنتجت Illumina). تم الكشف عن 114 تسلسلًا من 260 مليون ، أي ما يعادل 0.00004٪ من إجمالي التسلسلات. تم بعد ذلك تأكيد تسلسل جينوم الحصبة الألمانية يدويًا باستخدام برنامج BLAST (أداة البحث الأساسي للمحاذاة المحلية ، https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). لم تكتشف المكتبة المتسلسلة على عمق أقل (حوالي 12 مليون من تسلسلات المطابقة Illumina ، أي ما يعادل 6 ملايين جزء من تسلسل المكتبة) وجود أي قراءات تعزى إلى الحصبة الألمانية ، في هذه الدفعة.

كما تم التحقق من تسلسل الفيروسات الأخرى الموجودة في اللقاح (جدري الماء والحصبة والنكاف) بنفس الطريقة اليدوية ، مما يؤكد أنه تم تعيينها بشكل صحيح.


المُقدّمة

لقد أصبح الجيل الجديد من أجهزة التسلسل أدوات مختارة للتحليل التفصيلي في مجال علم الأحياء والطب ، وخاصة الدقة. تتيح هذه الأدوات نهجًا جديدًا وعالميًا لسلسلة من التطبيقات مثل تسلسل دي نوفو ، و metagenomics ، و epigenomics ، وتسلسل transcriptome وإعادة تسلسل الجينوم.

التطبيق الأخير (إعادة التسلسل) منتشر على نطاق واسع في المجال البشري لأغراض البحث والتشخيص ويتكون من التسلسل باستخدام تقنية NGS (تسلسل الجيل التالي) للجينوم الفردي بالكامل من أجل رسم خريطة لطفرات النوكليوتيدات الفردية (SNP ، النطق) snip ') ، حدثت عمليات إدراج وحذف تسلسلات طويلة أو أكثر في مواضع معينة من الجينوم والاختلافات في عدد نسخ أجزاء الجينوم / الجينات (CNV ، نسخ أرقام المتغيرات).

يتطلب إجراء التسلسل أن يتم تقسيم الحمض النووي للفرد ميكانيكيًا إلى أجزاء صغيرة الحجم (400-500 نقطة أساس) وترتبط هذه الأجزاء بمسالك من الحمض النووي الاصطناعي تسمى المحولات ، والتي تسمح بتثبيت شظايا الحمض النووي البشري على سطح زجاجي ثم يتم قراءة القواعد (A ، C ، G ، T).

يتم الحصول على قراءة الحمض النووي عن طريق دمج التفاعلات الكيميائية للنيوكليوتيدات الموسومة بجزيئات الفلورسنت. الملايين من التسلسلات (القراءات) التي يتم الحصول عليها عن طريق التسلسل التي حدثت على السطح الزجاجي ، ثم يتم تعيينها إلى مرجع الجينوم البشري باستخدام برنامج مناسب ، ومن ثم يتم تحديد جميع المتغيرات الموجودة في الجينوم الذي تم تحليله مقارنةً بالمرجع.

تم تنفيذ نفس الإجراء على الجينوم البشري الموجود في مجموعة Priorix Tetra® n. A71CB256A وعلى الحمض النووي المستخرج من خط خلايا MRC-5 ، المسجل في عام 1966 في ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC هي المنظمة العالمية الرائدة لموارد ومعايير المواد البيولوجية التي تركز مهمتها على الحصول على الكائنات الحية الدقيقة المرجعية وخطوط الخلايا وغيرها من المواد المعيارية البيولوجية والمصادقة عليها وإنتاجها وحفظها وتطويرها وتوزيعها. تأسست في عام 1925 ، عندما أدركت لجنة من العلماء الحاجة إلى مجموعة مركزية من المواد البيولوجية التي يمكن أن تخدم العلماء في جميع أنحاء العالم.

خط خلية MRC-5 مشتق من أنسجة الرئة الطبيعية من جنين ذكر يبلغ من العمر 14 أسبوعًا وتم إيداعه في ATCC بواسطة JP Jacobs في سبتمبر 1966. ويعلن أن هذه الخلايا قادرة على مضاعفة 42 إلى 46 من السكان قبل الشيخوخة. يبدأ. يعود المقال المرجعي لخط الخلية هذا إلى عام 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0


النتائج

كما هو موضح سابقًا ، فإن الحمض النووي البشري موجود في Priorix Tetra®. ن. A71CB256A (المشار إليه في الرسوم البيانية التالية باسم "عينة ID12051PT") هو جينوم فردي كامل ، أي أن الحمض النووي الجيني لجميع الكروموسومات للفرد الذكر موجود. تظهر الرسوم البيانية للتغطية (متوسط ​​العمق = متوسط ​​التغطية) للكروموسومات البشرية الـ 22 والكروموسومات X و Y أدناه للقاح (الصورة أعلاه) وخط خلايا MRC5 (الصورة أدناه).

كورفيلفا mrc5 1

فيما يلي نتائج تحليل الأنواع المختلفة من المتغيرات.


تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) وعمليات الإدراج / الحذف القصيرة (InDels)

إن متغيرات الحمض النووي الفردي الفردي (SNP ، وضوحا 'snip') هي تعدد الأشكال ، وهذا يعني اختلافات في المادة الوراثية ، التي تحملها نيوكليوتيد واحد. إن InDels عبارة عن إدخالات وحذفات صغيرة يقل طولها عن 50 نقطة أساس وتشكل فئة أخرى من المتغيرات الجينومية في الجينوم البشري.

SNP (تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة) - ID12051PT

كورفيلفا mrc5 1


SNP (تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة) - MRC-5

كورفيلفا mrc5 1


InDels (عمليات الإدراج / الحذف القصيرة) - ID12051PT

كورفيلفا mrc5 1


InDels (عمليات الإدراج / الحذف القصيرة) - MRC-5

كورفيلفا mrc5 1


CNV (نسخ رقم المتغيرات) و SV (المتغيرات الهيكلية)

متغيرات رقم النسخ (CNV) هي متغيرات جينومية بسبب الاختلافات في عدد نسخ الأجزاء الكبيرة نسبيًا (أطول من 50 نقطة أساس) في الجينومات الفردية. هناك نوعان من CNV: نوع "الكسب" (كسب النسخ) ونوع "الخسارة" (فقدان النسخ).

المتغيرات الهيكلية (SV) هي متغيرات جينومية ذات أبعاد كبيرة نسبيًا (> 50 bp) بما في ذلك الحذف والازدواجية والإدخالات والعاكسات والانتقالات.

CNV (متغيرات رقم النسخ)

كورفيلفا mrc5 1

كورفيلفا mrc5 1


SV (المتغيرات الهيكلية)

كورفيلفا mrc5 1كورفيلفا mrc5 1


التصور الدائري للجينوم (مؤامرة السيرك)

يظهر تمثيل رسومي للجينومين المسمى (مخطط السيرك) أدناه.

كورفيلفا mrc5 1

كورفيلفا mrc5 1


معنى مختلف الدوائر المتحدة المركز

  1. الدائرة الخارجية (الدائرة الأولى) هي رقم الكروموسوم.
  2. تمثل الحلقة الثانية (الزرقاء) تغطية لقراءات نمط الرسم البياني كل رسم الرحم هو متوسط ​​تغطية مساحة 0,5 ميجا بت.
  3. تمثل الحلقة الثالثة (أسود) كثافة INDELs في "نمط الرسم البياني المشتت". يتم حساب كل نقطة سوداء على أنها عدد INDELs (عمليات إدخال / حذف صغيرة) في نطاق 1 ميجا بت.
  4. تمثل الحلقة الرابعة (الخضراء) كثافة snp في "نمط الرسم البياني المشتت". يتم حساب كل نقطة خضراء على أنها عدد SNPs (تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة) في نطاق 1 ميجا بت.
  5. تمثل الحلقة الخامسة نسبة SNP متماثل الزيجوت (برتقالي) وغير متماثل (رمادي) في نمط الرسم البياني. يتم حساب كل رسم بياني من منطقة 1 ميجا بت.
  6. يمثل الحلقة السادسة الاستدلال CNV (متغيرات رقم النسخ). الأحمر يعني اكتساب قطع الحمض النووي والخضراء تعني الخسارة.
  7. تمثل الحلقة الأكثر مركزية الاستدلال SV (المتغيرات الهيكلية) في المناطق الغريبة والتضفير. TRA (نقل ، برتقالي) ، INS (إدخالات ، أخضر) ، DEL (حذف ، رمادي) ، DUP (مضاعفات ، وردي) ، و INV (عكسي ، أزرق).

استنتاجات

يظهر هذين الجينومين اختلافات مهمة. على وجه التحديد ، يتبين أن جينوم اللقاح قد تغير بشكل كبير مقارنة بجينوم الخلية المودعة في عام 1966. ويمكن القول أنه لم يكن لدينا إمكانية إجراء تسلسل خط الخلية الذي تستخدمه GlaxoSmithKline لإنتاج لقاح "بريوريكس تيترا" ، ولكن اللقاح الأصلي. شركات الأدوية التي تستخدم خطوط الخلايا لإنتاج الأدوية واللقاحات لها خط MRC-5 الخاص بها ، لكن هذا لا يغير شكوكنا ، أي حقيقة أن التحكم في الاستقرار الجيني غير مطلوب بشكل دوري أمر خطير للغاية ، في رأينا ، خاصة لأنه يُسمح بالتواجد بدون حد أقصى.


الاستنتاجات

يظهر الجينومان اختلافات مهمة. على وجه الخصوص ، تبين أن جينوم اللقاح قد تغير بشكل كبير مقارنةً بخط جين الخلية المودع في عام 1966. يجب أن يقال أنه لم يكن لدينا إمكانية تسلسل خط الخلية الذي يستخدمه GlaxoSmithKline لإنتاج لقاح Priorix Tetra ، ولكن ذلك من المخزون الأصلي. شركات الأدوية التي تستخدم خطوط الخلايا لإنتاج الأدوية واللقاحات ، لديها خط MRC-5 ولكن هذا لا يغير شكوكنا ، وهذا هو حقيقة أن السيطرة على الاستقرار الجيني ليست مطلوبة بشكل دوري وهذا أمر خطير للغاية في رأينا ، قبل كل شيء لأنه يُسمح بالتواجد بدون حدود.