أول منشور تمت مراجعته من قبل النظراء حول لقاحات MMRV (Priorix Tetra)

أول منشور تمت مراجعته من قبل النظراء حول لقاحات MMRV (Priorix Tetra)

أخيرًا ، ها نحن - بعد ما يقرب من عامين - يتم إصدار أول منشور تحليلي تمت مراجعته من قبل النظراء وسيتم نشر العديد من المنشورات الأخرى.

الهدف من هذه المقالة هو تلخيص القضايا التالية: ما تم نشره ، وما هي صلاحيته ، وسبب أهميته في تحقيقنا حول اللقاحات. سيتم التعامل مع جميع هذه الحجج بطريقة عامية وغير فنية في الصفحات الأولى ، بينما من الصفحة 3 فصاعدًا ، ستكون هناك دراسة فنية للسماح لأخصائيي هذا القطاع بتقييم المقالة في حد ذاتها.

المقال المنشور عن "F1000 Research"1 هو نتيجة الدراسة الأولية التي أجراها أحد المختبرات التي عينتها جمعية Corvelva لإجراء التحليلات. نذكرك - لأنه مرت أكثر من عامين منذ بداية هذا العمل وأضيف العديد من النتائج الأخرى إلى النتائج الأولى - كانت القضية الرئيسية الأولى التي كان علينا أن نبحثها هي الكمية غير الطبيعية من الحمض النووي البشري الموجودة داخل اللقاحات التي تم تحليلها.

أظهرت التحليلات الأولية أن كلاً من لقاح MMRV رباعي التكافؤ الذي تم تحليله يحتوي على 1 إلى 2.7 ميكروجرام / قارورة (كما تم نشره في هذه المقالة) وقررنا الإبلاغ عن هذه النتائج بشكل علني وفوري لأنه ببساطة ، لم يكن من المتوقع أن مثل هذه الكمية من يمكن أن يكون الحمض النووي موجودًا داخل اللقاح.

بصرف النظر عن الاعتبارات والاستنتاجات التي توصلت إليها الدراسة ، والتي هي تقنية بحتة وبالتالي لا يمكن فهمها إلا لأولئك الذين يعملون في مجال البحوث metagenomic ، ما لوحظ في الرسوم البيانية هو أن عينات اللقاح تحتوي على نسبة عالية من قراءات الحمض النووي البشري بالإضافة إلى تلك المتوقعة من جينوم فيروس جدري الماء (فيروس ألفا هربس البشري 3) ، وهو النوع الوحيد الذي يمكن اكتشافه من بين أربعة ، حيث تم عرض نوع تحليل DNA-seq في المقالة.

ومع ذلك ، نود أن نشير إلى أن كميات الحمض النووي التي تم العثور عليها وتأكيدها نفس الطريقة التي تم التحقق منها الآن هنا كانت أعلى: ما يصل إلى 3.7 ميكروغرام لكل قارورةمما يؤدي إلى فرق كبير من دفعة إلى أخرى. في الواقع ، في تقريرنا الصادر في 22 ديسمبر 20182 تم الإبلاغ عن النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل دفعات مختلفة من تلك التي نوقشت في هذه المقالة ، ثم تم تأكيدها من خلال التحليل بين المختبرات التي لا تزال قيد النشر.

لذلك ، ما يجب اعتباره ذا أهمية كبيرة في المنشور الحالي هو أنه يثبت الطريقة التي استخدمناها, يعطي نقطة مهمة للمناقشات حول "نوع" التحليل الذي تم, ونتيجة لذلك تؤكد بطريقة نهائية جميع الدراسات التي أجريت فيما بعد باستخدام طريقة NGS: التحليل المتعمق لنوع المادة الوراثية ، ووجود الفيروسات العرضية ، والغياب الكبير للفيروسات المخففة التي يجب أن تكون موجودة وكمية الحمض النووي البشري التي كانت خارجة عن السيطرة تمامًا (أيضًا بسبب اختلافها تمامًا من عينة إلى أخرى) والسكان المتحولون والعاقم والحمض النووي من الأنواع الأخرى ، وما إلى ذلك. يمكنك أن تجد aليرة لبنانية النتائج الملخصة على موقعنا على شبكة الإنترنت3.

كل شيء ندينه في السنوات الأخيرة ، من وجهة نظر بيولوجية ، يبلغ بدقة النتائج إلى هيئات المراقبة ، يأخذ دلالة علمية أكثر صلة (حتى لو كررناها مرة أخرى ، لم تكن مراجعات الأقران هي التي يجب أن تقلق لكن البيانات المقدمة ، خطيرة للغاية في محتواها وآثارها المحتملة على صحة الإنسان). ومع ذلك ، الآن بعد أن تم نشر الطريقة ، سوف نطالب بالإجابات التي لم نعطها بعد.

تؤكد هذه النتائج دون شك وجود الحمض النووي للجنين في لقاحات بريتيكس تيترا بكميات متغيرة من دفعة إلى أخرى ، مما يشير إلى ضعف مراقبة جودة هذه المنتجات الصيدلانية.

نود أيضًا أن نذكر التقرير بشأن تسلسل الجينوم MRC-5 بالكامل المنشور في موقع Corvelva على الويب في 27 سبتمبر 20194 يظهر التعديل العميق لهذا الحمض النووي حتى في الجينات المرتبطة بتطور أمراض الورم (سيتم نشر هذه البيانات أيضًا قريبًا). الحمض النووي للجنين الملوث الموجود في جميع العينات التي تم تحليلها بكميات متغيرة (أي غير خاضعة للرقابة) أعلى بما يصل إلى 300 مرة من الحد الذي تفرضه EMA على الحمض النووي المسرطن (10 نانوغرام / جرعة ، الموافق للحمض النووي الموجود في حوالي 1000 خلية سرطانية ، على أساس حساب إحصائي ، في حين أن الحد التحوطي هو 100 جزء من الغرام / جرعة) ، وهو الحد الذي يجب تطبيقه بالضرورة أيضًا على DNA الجنين الذي يلوث حتمًا لقاح Priorix Tetra.

ونتيجة لذلك ، يجب اعتبار هذا اللقاح معيبًا ومن المحتمل أن يكون خطرًا على صحة الإنسان ، خاصةً بالنسبة للأطفال الذين هم أكثر عرضة للتلف الجيني وتلف المناعة الذاتية بسبب عدم نضج أنظمة المناعة.

كما هو متوقع ، يعتبر الجزء التالي من المقالة أكثر "تقنيًا" ويصعب فهمه لغير الخبراء ، لذلك قررنا ، حتى لأغراض الشفافية ، إرفاق هذه الوثيقة أيضًا "EMA Dossier - NGS Dossier مناقشة حول نتائج مسح جودة اللقاح". كان علينا أن نستنبط فقط الجزء الذي يمكن نشره ، وهو 50 صفحة من الملف مقارنة بـ 200 صفحة من NGS ، حيث أن معظم المعلومات الواردة والمسجلة للهيئات التنظيمية يجب أن تظل سرية. يفرض قانون العلم الصارم أنه لا يمكن نشر جزء من المعلومات في إحدى المجلات إلا إذا كانت أصلية ، وبما أن لدينا أعمالًا أخرى قيد التقدم ، فإننا لا نريد تعريضها للخطر.

EMA - NGS Dossier مناقشة حول نتائج مسح جودة اللقاح ". - https://bit.ly/342XKi7

وأخيرًا ، لتجنب سوء الفهم ، نود أن نسلط الضوء على جزء "إعلان التمويل" من المنشور المذكور أعلاه:

"تم تمويل التسلسل metagenomic B1 و B2 من قبل Corvelva (جمعية غير ربحية ، فينيتو ، إيطاليا) ، بموجب عقد خدمة مع المختبر. ولم تشارك أي مساهمة أخرى في دعم العمل. ولم يكن للممولين دور في تصميم دراسة وجمع وتحليل البيانات ، قرار النشر أو إعداد المخطوطة "


تعلق:


في المقال "هل تريدني؟ تأثير تخفيض التغطية على دراسات تسلسل بندقية ميتاجينوم "

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

يعالج المؤلفون السؤال التقني المنهجي ما إذا كان من الممكن استخدام نهج ميتاجينومي متوازي بشكل كبير مع تغطية قراءة منخفضة لوصف المصفوفات البيولوجية المعقدة. تقديرات التنوع ووفرة الأنواع والقدرة على إعادة بناء metagenome دي نوفو من حيث الطول والاكتمال يتم حسابهما ، من أجل فهم مدى تأثير الانخفاض في عمق التسلسل ، والذي يختلف باختلاف قراءات التسلسل العشوائي ، على النتائج النهائية. أظهرت النتائج أنه يمكن تقدير مؤشرات التنوع للمجموعات بدائية النواة وحقيقيات النوى والفيروسية المعقدة بدقة مع 500,000 قراءات أو أقل ، على الرغم من أن العينات المعقدة بشكل خاص قد تتطلب 1,000,000 قراءات ، بل على العكس من ذلك ، فإن المشروع الذي يتضمن إعادة بناء الميتاجينوم والجينات فيه يحتوي على أكثر من مليون قراءة.

من بين المصفوفات المعقدة المختلفة ، والمختلفة تمامًا عن بعضها البعض ، والتي خضعت للتحليل الهائل للميتاجينوميك ، تم تضمين دوائين بيولوجيين ، وهما دفعتان مختلفتان من لقاح MPRV الموهن الحي المستخدم في التحصين ضد الحصبة والنكاف والحصبة الألمانية وجدري الماء عند الأطفال. تم استخراج الحمض النووي من اللقاحات ، وتم بناء المكتبات الجينومية باستخدام البروتوكولات التجارية القياسية وتم تنفيذ التسلسل الضخم باستخدام تقنية Illumina.

بصرف النظر عن الاعتبارات والاستنتاجات التي توصل إليها العمل ، والتي هي تقنية بحتة وبالتالي لا يمكن فهمها إلا لأولئك الذين يقومون بالبحث في مجال metagenomics ، ما يتم ملاحظته في المخططات الدائرية الواردة في `` البيانات الموسعة '' (https://osf.io/wq395/ النموذجان B1 و B2): وجد أن عينتي اللقاح تحتويان على نسبة عالية من قراءات الحمض النووي البشري بالإضافة إلى تلك المتوقعة من جينوم فيروس جدري الماء (الإنسان الهربسي الألفائي فيروس 3) ، الوحيد الذي يمكن اكتشافه بين الأربعة، حيث تم تقديم تحليل نوع DNA-seq في المقالة.

71 ٪ من القراءات في دفعة واحدة و 88 ٪ في الأخرى من أصل بشري ، يُفترض أنها مشتقة من خط خلايا الجنين MRC-5 (تذكر أن التحليل اللاحق أكد أن الخط هو MRC5) حيث تكون فيروسات الحصبة الألمانية وفيروس جدري الماء الموهنة الحية نمت أثناء إعداد اللقاح. علاوة على ذلك ، كما حدث في دفعات مختلفة من نفس لقاح MPRV الذي تم اختباره من قبل Corvelva بين عامي 2017 و 2019 ، فإن كمية الحمض النووي المستخرجة من ترتيب ميكروغرام.

في دفعات اللقاح التي تم اختبارها بنفس البروتوكولات والتكنولوجيا المذكورة في مواد وأساليب المقالة ، تراوحت الكميات المكتشفة من 1 إلى 3 ميكروجرامات لكل قارورة ، وتختلف الكميات بين الدفعات ، ولكنها دائمًا مهمة.

كورفيلفا mprv1

B1 https://osf.io/86mbn/

كورفيلفا mprv1

B2 https://osf.io/dxayz/

في التقرير الذي نشرته Corvelva في 22.12.2018 5، تم الإبلاغ عن النتائج التالية لمزيد من الدفعات التي تم تحليلها بعد تلك التي تمت مناقشتها في المقالة ، والتي تم تأكيدها لاحقًا من خلال التحليل بين المختبرات الذي لا يزال قيد النشر.

بريوريكس تيترا الكثير. A71CB205A (يونيو 2018) - تحليل الحمض النووي

كورفيلفا mprv3

بريوريكس تيترا الكثير. A71CB256A (ديسمبر 2018) - تحليل الحمض النووي

كورفيلفا mprv3

تحليل الحمض النووي

أظهر قياس تركيز الحمض النووي باستخدام جهاز قياس الفلورة QuBit أن كمية A71CB205A تحتوي على إجمالي 1.7 ميكروغرام من غدنا لكل جرعة 0.5 مل ، محسوبة على النحو التالي: 9.41ng / µl (التركيز المحدد عند QuBit) × 45 (حجم إعادة التعليق النهائي للحمض النووي بعد الاستخراج ، معبرًا عنه في ميكروليتر) × 4 (حجم البدء المقدم لعملية الاستخراج هو ¼ من حجم الجرعة الموجودة في القارورة بأكملها 0.5 مل).

قياس الحمض النووي أظهر تركيزه مع الفلورومتر QuBit أن A71CB256A الكثير يحتوي على المجموع غدنا 3.7 ميكروغرام لكل جرعة 0.5 مل، محسوبة على النحو التالي: 40.8 نانوغرام / ميكرولتر (التركيز المحدد عند QuBit) × 55 (حجم إعادة التعليق النهائي للحمض النووي بعد الاستخلاص المعبر عنه في الميكروليتات) × 5/3 (حجم البداية المقدم إلى إجراء الاستخراج هو 300 ميكرولتر على 500 ميكرولتر من التعليق ).

الحمض النووي البشري الموجود في هذه الدفعة هو حوالي 8 إلى 1 نسبة إلى الحمض النووي لجدري الماء (انظر النتائج التالية لتصنيف شظايا DNA-seq ، والتي تظهر أن 88 ٪ من إجمالي أجزاء الحمض النووي المتسلسلة من أصل بشري ، و 11 ٪ هي من جينوم فيروس جدري الماء).

وبالنظر إلى أن NGS هي تقنية كمية ، فإن القياس الكمي الفلوري لإجمالي الحمض النووي المستخرج من اللقاح (على سبيل المثال الكثير A71CB256A = 3.7 ميكروغرام لكل جرعة) ، جنبًا إلى جنب مع النظر في القياس النسبي المذكور أعلاه (8: 1) ، يسمح لنا بالقول أن الإنسان يمكن أن يكون الحمض النووي حوالي 2.9 ميكروغرام لكل جرعة ، مقارنة بحوالي 740 نانوجرام من الحمض النووي للجدري. ومن المعقول أن يمكن أن يكون جزء واحد على الأقل من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي الذي يتم رؤيته على الهلام عبارة عن حمض نووي عالي الوزن الجزيئي.

تحليل الحمض النووي الريبي

كمية RNA المدرجة في قارورة اللقاح تحول الكثير A71CB256A إلى حوالي 200ng.

يشير RIN يساوي 8 إلى نوعية ممتازة RNA و RNA حقيقية النواة سليمة ، بما أن القمم 18S و 28S النموذجية للحمض النووي الريبي الحقيقي النواة موجودة.

إن الإجابات على أسئلتنا التي يتم توجيهها إلى الهيئات التنظيمية بمرور الوقت مهمة للغاية. في الوقت الحالي ، لم تجب الوكالات حتى الآن على الأسئلة المتعلقة بنتائج التحليلات الكاملة المقدمة إلى EMA و AIFA.

مقتطف من الرد المقدم من EMA على سؤالنا بشأن سلامة بقايا MRC-5 في لقاح ®Tetra Priorix (مرجع طلب EMA ask-43967 3 أغسطس 2018) - "استنادًا إلى المعلومات المنشورة ، تحتوي Priorix® Tetra على سلالات فيروسية يتم إنتاجها بشكل منفصل في خلايا جنين الدجاج (النكاف والحصبة) أو في الخلايا ثنائية الصبغة البشرية MRC-5 (الحصبة الألمانية والجدري). تتضمن خطوط الخلايا المستخدمة في Priorix® Tetra خطوط الخلايا ثنائية الصبغة البشرية التي لا يمكن تقسيمها باستمرار. لاحظ أنه وفقًا لدستور الأدوية الأوروبي ، خطوط الخلايا ثنائية الصبغة MRC-5 ليست مولدة للأورام ، كما يتضح من عقود من الاستخدام والتحكم ، وبالتالي لا ينطبق الحد الأقصى للحمض النووي لخلايا MRC-5 "

حتى اليوم ، لم يتم تقديم أي دليل (لا من حيث شهادات التحليل على جودة المنتج ، ولا من المؤلفات العلمية المرجعية لـ EMA) لهذه الضوابط التي تضمن أنه من المناسب عدم تطبيق حد أقصى.

في إرشادات إدارة الأغذية والعقاقير "إرشادات الصناعة: توصيف وتأهيل ركائز الخلية والمواد البيولوجية الأخرى المستخدمة في إنتاج اللقاحات الفيروسية لمؤشرات الأمراض المعدية"6 يذكر أن:

  • يجب أن تبقى سلالة من الخلايا ثنائية الصبغية ثنائية الصبغة دائمًا. إذا كانت هذه الخصائص غير مستقرة ، فمن الضروري إثبات أن عدم الاستقرار لا يؤثر سلبًا على إنتاج المنتج أو مطابقته.
  • بالنسبة لسلالات الخلايا ثنائية الصبغة البشرية المستخدمة على نطاق واسع ، مثل خلايا MRC-5 و WI-38 ، قد لا يكون قياس الحمض النووي المتبقي ضروريًا لأننا لا نعتبر الحمض النووي المتبقي لهذه الخلايا ثنائية الصبغيات البشرية مصدر قلق للسلامة
  • يجب أن يكون الحمض النووي المتبقي محدودًا للخلايا المستمرة غير الورمية ، مثل الخلايا الحقيقية مع عدد قليل من الممرات ، أقل من 10 نانوغرام / جرعة للتلقيح بالحقن على النحو الموصى به من قبل منظمة الصحة العالمية

والمبادئ التوجيهية لمنظمة الصحة العالمية "الملحق 3 - توصيات لتقييم مزارع الخلايا الحيوانية كركائز لتصنيع الأدوية البيولوجية وتوصيف البنوك الخلوية. استبدال الملحق 1 من سلسلة التقارير التقنية لمنظمة الصحة العالمية ، ن. 878 "يضيف: (...) تراكمت خبرة كبيرة في علم الوراثة الخلوية WI-38 و MRC-5 منذ الستينيات ولدعم هذه التجربة ، تم سرد المقالات التالية:

  • جاكوبس جي بي. تم تحديث النتائج في علم كاريولوجيا السلالات الخلوية WI-38 و MRC-5 و MRC-9. التطورات في التقييس البيولوجي ، 1976 ، 37: 155–156.
  • جاكوبس جي بي. وآخرون. مبادئ توجيهية لقبول الخلايا ثنائية الصبغيات البشرية المنتشرة بشكل متسلسل وإدارتها واختبارها لإنتاج لقاحات الفيروسات الحية لاستخدامها في الإنسان. مجلة التوحيد البيولوجي ، 1981 ، 9: 331–342.
  • Petricciani JC et al. معايير علم الكاريولوجي لخط الخلية المزدوجة الريسوس DBS-FRhL-2. مجلة التوحيد البيولوجي ، 1976 ، 4: 43-49.
  • شولماير وآخرون. تحليل عالي الدقة وتكثيف تفاضلي في الكروموسومات البشرية ذات النطاق RBA. علم الوراثة البشرية ، 1981 ، 59: 187-193.
  • رون م. إعداد الكروموسوم وتقنيات ربط عالية الدقة: مراجعة. مجلة علوم الألبان ، 1989 ، 72: 1363-1377.

يمكن ملاحظة أن المؤلفات المرجعية التي تؤكد أن الخلايا ثنائية الصبغ المستخدمة في إنتاج اللقاحات آمنة من وجهة نظر الاستقرار الجيني ، عفا عليه الزمن. قبل 40 عامًا ، تم العثور على أول شذوذ وراثي ، يُعتبر ضئيلًا بالنسبة لسلامة اللقاحات ، ومن ما تم الإبلاغ عنه في إرشادات منظمة الصحة العالمية ، ومنذ ذلك الحين لم يتم إجراء تحديثات على تقنيات التسلسل الجديدة ، لا سيما في NGS ، والتي علاوة على ذلك الاقتصادية والسريعة ، مما يترتب على ذلك في اللقاحات تدار لعقود من الزمن سمحت الوكالات بوجود الحمض النووي المعدل وراثيا بشكل متزايد وبكميات غير خاضعة للرقابة. حول هذا الموضوع ، انظر التقرير حول تسلسل جينوم MRC-5 بالكامل المنشور على موقع Corvelva على الويب في 27.09.2019 والذي يظهر فيه التعديل العميق لهذا الحمض النووي في الجينات المرتبطة بتطور أمراض الورم. (يتم نشر البيانات)

فيما يلي مقتطف من الرسالة التي كتبها د. ت. ديشر - خبير عالمي في استخدام الخلايا الجذعية للأغراض العلاجية والعلاج الجيني - والتي تسلط الضوء على القلق من المخاطر المرتبطة باستخدام اللقاحات الملوثة ببقايا خلايا الجنين البشرية. :

د. ت. ديشر (رسالة إلى المحافظين - 8 أبريل 2019) - (...) إن حقن أطفالنا بتلوث الحمض النووي للجنين البشري ينطوي على خطر التسبب في مرضين مدمجين:

  • الطفرات الجينية: يتم دمج الحمض النووي للجنين في الحمض النووي للطفل مما يسبب طفرات. أظهر العلاج الجيني باستخدام إعادة التركيب البسيط للشظايا الصغيرة أن الكميات الصغيرة مثل 1.9 نانوغرام / مل من أجزاء الحمض النووي تؤدي إلى إدخال الخلايا الجذعية في الجينوم في 100 ٪ من الفئران المحقونة. تصل مستويات شظايا الحمض النووي للأجنة البشرية في أطفالنا بعد التطعيم بلقاحات MMR أو VARIVAX (جدري الماء) أو التهاب الكبد A إلى مستويات أعلى من 1.9 نانوغرام / مل.
  • مرض يصيب جهاز المناعه: الحمض النووي البشري الجنيني يحفز رد فعل الجهاز المناعي لمهاجمة جسم الطفل.

نتائجنا تعزز بشكل كبير الملاحظات التجريبية للدكتور Deisher ، قبل كل شيء حقيقة أن الحمض النووي للجنين الملوث الموجود في جميع العينات التي تم تحليلها بكميات متغيرة (وبالتالي غير خاضعة للرقابة) هو ما يصل إلى 300 مرة من الحد الذي تفرضه EMA للحمض النووي المسرطن (10 نانوغرام / جرعة ، المقابلة للحمض النووي الموجود في حوالي 1000 خلية سرطانية ، تم الحصول عليها على أساس حساب إحصائي ، في حين أن الحد الوقائي هو 100 جزء من الغرام / جرعة) يجب أن يطبق بالضرورة أيضًا على DNA الجنين الذي يلوث حتمًا Priorix® Tetra.

لذلك ، يجب اعتبار هذا اللقاح معيبًا ومن المحتمل أن يكون خطرًا على صحة الإنسان ، لا سيما في الأطفال الأطفال الذين هم أكثر عرضة للتلف الجيني وتلف المناعة الذاتية بسبب عدم النضج في أنظمة الإصلاح.


  1. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
  2. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate.html
    https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate-en.html
  3. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/
  5. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
  6. https://www.federalregister.gov/documents/2010/03/04/2010-4553/guidance-for-industry-characterization-and-qualification-of-cell-substrates-and-other-biological