مقارنة بين الجينوم البشري الموجود في Priorix Tetra وخط خلايا MRC-5

مقارنة بين الجينوم البشري الموجود في Priorix Tetra وخط خلايا MRC-5

عرض موجز للنتائج

نقدم اليوم دراسة أخرى مهمة جدًا حول التسلسل الجينومي لخط الخلية الموجود داخل اللقاح رباعي التكافؤ MPRV (الحصبة والحصبة الألمانية والنكاف وجدري الماء) Priorix Tetra ، وخط خلايا MRC-5 (وهو الخط المعلن عنه في تطوير لقاح نفسه).

تلخيص التقارير المنشورة السابقة:

  1. أظهرنا أولاً كيف أن كمية الحمض النووي الموجودة في اللقاح المذكور كان أعلى بكثير من المسموح به;
  2. ثم تحققنا من أن خط الخلية هو في الواقع MRC-5 المعلنة;
  3. انتقلنا بعد ذلك إلى تسلسل الجينوم لخط الخلية المستخرج مباشرة من اللقاح، وتسليط الضوء على الطفرات الثقيلة للغاية التي تنطوي على احتمال وجود مخاطر صحية خطيرة في استخدام هذا اللقاح.

ما نقدمه هنا هو بالتحديد عمل المقارنة بين الجينومين: ما وجدناه بالفعل في اللقاح ولقاح MRC-5 الذي تم شراؤه من قاعدة بيانات ATCC.

والنتيجة هي أن الخطين يقدمان اختلافات مهمة من وجهة نظر الاستقرار الجيني. على وجه الخصوص ، يبدو أن جينوم اللقاح تم تعديله بشكل كبير مقارنة بجينوم الخلية المودعة في عام 1966.

وهذا يعني أن المنتجين ، في هذه الحالة من Priorix tetra ، قد اشتروا خط الخلية في الظروف المثلى من وجهة نظر الاستقرار الجيني ومع الاستخدام المستمر بمرور الوقت لغرض الإنتاج ، قاموا بطرح اللقاحات التي تحتوي على المواد الوراثية البشرية في السوق بشكل تدريجي تعديل متزايد وخطير على صحة اللقاح.

نظرًا لأن الوكالات التنظيمية لا تتطلب مراقبة دورية للاستقرار الجيني لخطوط الجنين ولا تحدد حتى الحد الأدنى من الأمان ، يمكننا أن نستنتج أن هذا مطلب أساسي لجودة وسلامة اللقاحات التي تم تم الحصول عليها من خطوط الخلايا البشرية ، أي الحاجة إلى التحقق من أنها لا تكتسب طفرات وإعادة ترتيب يحتمل أن تكون خطرة وضمان القضاء على بقايا معالجة المواد الوراثية إن وجدت.

ليس من حقنا تحديد أي جزء من عملية الإنتاج أو الحفظ يمكن أن يؤثر على جودة المنتج وسلامته ، ولكن ما يمكننا أن نشهده اليوم من خلال نشر هذا التقرير هو أنه من الملح للهيئات الرقابية إجراء فحص شامل للنتائج التي أبرزتها تحليلاتنا. في هذين العامين ، تركيز الانتباه على المنتج النهائي ، وبيعه وإدارته وليس فقط على "المكونات" المرخصة الفردية.

تذكر مرة أخرى أن هذه المنتجات هي جزء من تقويم التطعيم الإيطالي ويتم إعطاؤها حاليًا إلزاميًا للأطفال الأطفال في بلدنا وكذلك الدول الأوروبية الأخرى وبشكل عام في جميع أنحاء العالم.

تتحمل الهيئات الرقابية مسؤولية هائلة عن السلامة التي يتم الإعلان عنها حاليًا بالكلمات ولكن في الواقع ، على ما يبدو ، وكما يبدو من تحليلاتنا ، لا يمكن ضمانها ويتم تجاهلها بشكل واضح.


التصور الدائري للجينوم (مؤامرة السيرك)

يظهر تمثيل رسومي للجينومين المسمى "مخطط السيرك" أدناه.

كورفيلفا mrc5 1

معنى مختلف الدوائر متحدة المركز

  1. الدائرة الخارجية (الدائرة الأولى) هي رقم الكروموسوم.
  2. الحلقة الثانية (الزرقاء) تمثل تغطية القراءات بأسلوب الرسم البياني. كل رسم بياني هو متوسط ​​تغطية مساحة 0,5 ميجا بت.
  3. تمثل الحلقة الثالثة (أسود) كثافة INDELs بأسلوب "الرسم البياني للتشتت". يتم حساب كل نقطة سوداء على أنها عدد INDELs (عمليات الإدراج / الحذف الصغيرة) في نطاق 1 ميجا بت.
  4. تمثل الحلقة الرابعة (الخضراء) كثافة snp في نمط "الرسم البياني للتشتت". يتم حساب كل نقطة خضراء على أنها عدد SNPs (متغيرات النوكليوتيدات المفردة) في نطاق 1 ميجا بت.
  5. تمثل الحلقة الخامسة نسبة اللزوجة المتجانسة (البرتقالية) والغلطة المتغايرة (الرمادية) SNP في نمط الرسم البياني. يتم حساب كل رسم بياني من منطقة 1 ميجا بت.
  6. الحلقة السادسة تمثل استنتاج CNV (المتغيرات في عدد النسخ). الأحمر يعني الحصول على قطع من الحمض النووي والخضراء تعني الخسارة.
  7. تمثل الحلقة الأكثر مركزية استدلال SV (المتغيرات الهيكلية) في المناطق الغريبة والتضفير. BETWEEN (برتقالي ، نقلي) ، INS (أخضر ، إدخالات) ، DEL (حذف ، رمادي) ، DUP (مضاعفات ، وردي) و INV (عكسي ، أزرق).

الاستنتاجات

يظهر الجينومان اختلافات مهمة. على وجه الخصوص ، تبين أن جينوم اللقاح قد تغير بشكل كبير مقارنةً بخط جين الخلية المودع في عام 1966. يجب أن يقال أنه لم يكن لدينا إمكانية تسلسل خط الخلية الذي يستخدمه GlaxoSmithKline لإنتاج لقاح Priorix Tetra ، ولكن ذلك من المخزون الأصلي. شركات الأدوية التي تستخدم خطوط الخلايا لإنتاج الأدوية واللقاحات ، لديها خط MRC-5 ولكن هذا لا يغير شكوكنا ، وهذا هو حقيقة أن السيطرة على الاستقرار الجيني ليست مطلوبة بشكل دوري وهذا أمر خطير للغاية في رأينا ، قبل كل شيء لأنه يُسمح بالتواجد بدون حدود.


تنزيل: CORVELVA المقارنة من إنسان الجينوم Priorix-تترا والخط-MRC-5.pdf


مقارنة بين الجينوم البشري الوارد في Priorix Tetra وخط خلايا MRC-5 (معيار ATCC MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

تم إثبات وجود فيروس الحصبة الألمانية عن طريق تسلسل مكتبة RNA-seq عميقة للغاية (تم إنتاج ما يقرب من 260 مليون تسلسل Illumina). تم الكشف عن 114 من أصل 260 مليون تسلسل ، أي ما يعادل 0.00004٪ من التسلسل الكلي. تم بعد ذلك تأكيد تسلسل جينوم الحصبة الألمانية يدويًا باستخدام برنامج BLAST (أداة البحث الأساسي للمحاذاة المحلية ، https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). لم تكتشف المكتبة المتسلسلة على عمق أقل (حوالي 12 مليون تسلسل مزدوج من Illumina ، أي ما يعادل 6 ملايين قطعة مكتبة متسلسلة) وجود أي قراءات تعزى إلى الحصبة الألمانية في هذه القطعة.

تم التحقق من تسلسل الفيروسات الأخرى الموجودة في اللقاح (جدري الماء والحصبة والنكاف) بنفس الطريقة اليدوية ، مما يؤكد أنه تم تعيينها بشكل صحيح.


مقدمة

لقد أصبح الجيل الجديد من أجهزة التسلسل أدوات مختارة للتحليلات المتعمقة في مجال علم الأحياء والطب ، وخاصة الدقة. تتيح هذه الأدوات نهجًا جديدًا وعالميًا لسلسلة من التطبيقات مثل تسلسل دي نوفو ، و metagenomics ، و epigenomics ، وتسلسل transcriptome ، وإعادة تسلسل الجينوم.

هذا التطبيق الأخير (إعادة التسلسل) منتشر على نطاق واسع جدًا في المجال البشري لأغراض البحث والتشخيص ويتكون من التسلسل باستخدام تقنية NGS (تسلسل الجيل التالي) لجينوم فردي بالكامل من أجل رسم خريطة لطفرات النوكليوتيدات الفردية (SNP ، قنص النطق) ') ، حدثت عمليات حذف وحذف تسلسلات طويلة أكثر أو أقل في مواضع معينة من الجينوم واختلافات في عدد نسخ أجزاء الجينوم / الجينات (CNV ، نسخ عدد النسخ).

يتطلب إجراء التسلسل أن يتم تقسيم الحمض النووي للفرد ميكانيكيًا إلى أجزاء صغيرة (400-500 زوجًا أساسيًا) وأجزاء من مسالك الحمض النووي الاصطناعي تسمى المحولات مرتبطة بالشظايا ، مما يسمح بربط أجزاء الحمض النووي البشري إلى سطح زجاجي تُقرأ عليه القواعد (A ، C ، G ، T). تتم قراءة قواعد الحمض النووي عن طريق دمج التفاعلات الكيميائية للنيوكليوتيدات المسمى بجزيئات الفلورسنت. يتم بعد ذلك تعيين الملايين من المتواليات (القراءات) التي تم الحصول عليها من التسلسل على السطح الزجاجي على الجينوم المرجعي البشري ببرنامج مناسب ثم يتم تحديد جميع المتغيرات الموجودة في الجينوم المحلل مقارنة بالمرجع.

تم تنفيذ نفس الإجراء على الجينوم البشري الموجود في مجموعة Priorix Tetra. ن. A71CB256A وعلى الحمض النووي المستخرج من خط خلية MRC-5 ، المودعة في عام 1966 في ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC هي المنظمة الرائدة في العالم لموارد ومعايير المواد البيولوجية التي تركز مهمتها على الاستحواذ ، والمصادقة ، والإنتاج ، والتخزين ، وتطوير وتوزيع الكائنات الحية الدقيقة المرجعية ، وخطوط الخلايا والمواد البيولوجية القياسية الأخرى. تأسست في عام 1925 ، عندما أدركت لجنة من العلماء الحاجة إلى مجموعة مركزية من المواد البيولوجية التي يمكن أن تخدم العلماء في جميع أنحاء العالم.

خط خلية MRC-5 مشتق من أنسجة الرئة الطبيعية من جنين ذكر يبلغ من العمر 14 أسبوعًا ، وتم إيداعه في ATCC بواسطة JP Jacobs في سبتمبر 1966. ويقال أن هذه الخلايا قادرة على مضاعفة 42 إلى 46 من السكان قبل البدء. الشيخوخة. يعود المقال المرجعي لخط الخلية هذا إلى عام 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0


النتائج

كما هو موضح سابقًا ، فإن الحمض النووي البشري موجود في Priorix Tetra. ن. A71CB256A (المشار إليه في الرسوم البيانية التالية كعينة ID12051PT) هو جينوم فردي كامل أو DNA جيني لجميع الكروموسومات للفرد الذكر. تظهر الرسوم البيانية للتغطية (متوسط ​​العمق = متوسط ​​التغطية) للكروموسومات البشرية الـ 22 والكروموسومات X و Y أدناه للقاح (الصورة أعلاه) وخط خلايا MRC5 (الصورة أدناه).

كورفيلفا mrc5 1

تظهر نتائج تحليل الأنواع المختلفة من المتغيرات أدناه.


متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNP) والإدخالات / عمليات الحذف القصيرة (InDels)

إن تنوع قواعد الحمض النووي الفردي (SNP ، وضوحا 'القصاص') هي أشكال متعددة ، وهي اختلافات في المادة الوراثية ، يتحملها نيوكليوتيد واحد. من ناحية أخرى ، فإن InDels عبارة عن إدخالات وحذفات صغيرة يقل طولها عن 50 نقطة أساس وتشكل فئة أخرى من المتغيرات الجينومية في الجينوم البشري.

SNP (متغيرات النوكليوتيدات المفردة) - ID12051PT

كورفيلفا mrc5 1


SNP (متغيرات النوكليوتيدات المفردة) - MRC-5

كورفيلفا mrc5 1


INDELs (عمليات الإدراج / الحذف الصغيرة) - ID12051PT

كورفيلفا mrc5 1


INDELs (عمليات إدخال / حذف صغيرة) - MRC-5

كورفيلفا mrc5 1


CNV (نسخ رقم المتغيرات) و SV (المتغيرات الهيكلية)

المتغيرات في عدد النسخ (CNV) هي متغيرات جينومية بسبب الاختلافات في عدد نسخ الأجزاء الكبيرة نسبيًا (أطول من 50 نقطة أساس) بين الجينومات الفردية. هناك نوعان من CNV: نوع "الكسب" (كسب النسخ) ونوع "الخسارة" (فقدان النسخ).

المتغيرات الهيكلية (SV) هي متغيرات جينومية ذات أبعاد كبيرة نسبيًا (> 50 نقطة أساس) ، بما في ذلك عمليات الحذف والازدواجية والإدخالات والعاكسات والانتقالات.

CNV (الاختلافات في عدد النسخ)

كورفيلفا mrc5 1

كورفيلفا mrc5 1


SV (المتغيرات الهيكلية)

كورفيلفا mrc5 1كورفيلفا mrc5 1


التصور الدائري للجينوم (مؤامرة السيرك)

يظهر تمثيل رسومي للجينومين المسمى "مخطط السيرك" أدناه.

كورفيلفا mrc5 1

كورفيلفا mrc5 1


معنى مختلف الدوائر متحدة المركز

  1. الدائرة الخارجية (الدائرة الأولى) هي رقم الكروموسوم.
  2. الحلقة الثانية (الزرقاء) تمثل تغطية القراءات بأسلوب الرسم البياني. كل رسم بياني هو متوسط ​​تغطية مساحة 0,5 ميجا بت.
  3. تمثل الحلقة الثالثة (أسود) كثافة INDELs بأسلوب "الرسم البياني للتشتت". يتم حساب كل نقطة سوداء على أنها عدد INDELs (عمليات الإدراج / الحذف الصغيرة) في نطاق 1 ميجا بت.
  4. تمثل الحلقة الرابعة (الخضراء) كثافة snp في نمط "الرسم البياني للتشتت". يتم حساب كل نقطة خضراء على أنها عدد SNPs (متغيرات النوكليوتيدات المفردة) في نطاق 1 ميجا بت.
  5. تمثل الحلقة الخامسة نسبة اللزوجة المتجانسة (البرتقالية) والغلطة المتغايرة (الرمادية) SNP في نمط الرسم البياني. يتم حساب كل رسم بياني من منطقة 1 ميجا بت.
  6. الحلقة السادسة تمثل استنتاج CNV (المتغيرات في عدد النسخ). الأحمر يعني الحصول على قطع من الحمض النووي والخضراء تعني الخسارة.
  7. تمثل الحلقة الأكثر مركزية استدلال SV (المتغيرات الهيكلية) في المناطق الغريبة والتضفير. BETWEEN (برتقالي ، نقلي) ، INS (أخضر ، إدخالات) ، DEL (حذف ، رمادي) ، DUP (مضاعفات ، وردي) و INV (عكسي ، أزرق).

الاستنتاجات

يظهر الجينومان اختلافات مهمة. على وجه الخصوص ، تبين أن جينوم اللقاح قد تغير بشكل كبير مقارنةً بخط جين الخلية المودع في عام 1966. يجب أن يقال أنه لم يكن لدينا إمكانية تسلسل خط الخلية الذي يستخدمه GlaxoSmithKline لإنتاج لقاح Priorix Tetra ، ولكن ذلك من المخزون الأصلي. شركات الأدوية التي تستخدم خطوط الخلايا لإنتاج الأدوية واللقاحات ، لديها خط MRC-5 ولكن هذا لا يغير شكوكنا ، وهذا هو حقيقة أن السيطرة على الاستقرار الجيني ليست مطلوبة بشكل دوري وهذا أمر خطير للغاية في رأينا ، قبل كل شيء لأنه يُسمح بالتواجد بدون حدود.