אלומיניום ברקמת המוח של נבדקים אוטיסטים

JTEMB אדג'ובנט אלומיניום 04 פבואר 2017

כתב העת למרכיבי עקבות ברפואה ובביולוגיה
סופרים: מתיו מולד, דורקס אומאר, אנדרו קינג, כריסטופר אקסלי
26 נובמבר 2017

תַקצִיר

הפרעה בספקטרום האוטיזם היא הפרעת התפתחות נוירולוגית של אטיולוגיה לא ידועה (סיבה). מוצע כי הסיבה כוללת הן רגישות גנטית והן גורמים סביבתיים, הכוללים בסופו של דבר גם רעלים סביבתיים. נעשו ניסיונות לקשר בין חשיפה אנושית לרעלן האלומיניום הסביבתי להפרעה בספקטרום האוטיזם. כאן השתמשנו בטכניקה של ספקטרומטריית קליטה אטומית מחוממת לרוחב (ספקטרומטריה לקליטה אטומית מכבשן גרפיט מחומם רוחבי) כדי למדוד, לראשונה, את תכולת האלומיניום ברקמת המוח של נבדקים התורמים עם אבחנה של אוטיזם. השתמשנו גם בפלואור סלקטיבי לאלומיניום לזיהוי אלומיניום ברקמת המוח באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. תוכן האלומיניום של רקמת המוח באוטיזם היה גבוה בהחלט. הממוצע (בסוגריים סטיית התקן) של תכולת האלומיניום ב -5 הפרטים לכל אונה היה 3,82 (5,42), 2,30 (2,00), 2,79 (4,05) ו -3,82, 5,17 (15) מיקרוגרם / גרם ממשקל החומר היבש עבור האונות האוקספיטליות, הפרונטליות, הזמניות והפריאליות בהתאמה. אלה הם הערכים הגבוהים ביותר של אלומיניום ברקמות מוח אנושיות שנמדדו עד כה וצריך לתהות מדוע למשל, תוכן האלומיניום של האונה האפקטיטאלית של ילד בן 8,74 צריך להיות 11,59 (10) מיקרוגרם / גרם משקל של חומר יבש? מיקרוסקופיית פלואורסצנט סלקטיבית מאלומיניום שימשה לזיהוי אלומיניום ברקמת המוח של XNUMX תורמים. אומנם ניתן היה לדמיין שאלומיניום קשור לנוירונים, אך נראה כי הוא קיים באזור התוך תאי בתאים הדומים למיקרוגליה ובשאר התאים הדלקתיים הלא נוירוניים של קרום המוח, כלי הדם, חומר אפור וחומר לבן. בולטת האלומיניום התוך-תאי הקשורה לתאים שאינם עצביים הייתה תצפית יוצאת דופן ברקמת המוח של נבדקים אוטיסטים ויכולה להציע רמזים הן לגבי מקור האלומיניום הקיים במוח והן לגבי התפקיד האפשרי של חומר זה בגרימת הפרעת המחלה. ספקטרום אוטיסט.

מבוא

הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) היא קבוצה של מצבים פתולוגיים של התפתחות נוירולוגית של סיבה לא ידועה. גורמים גנטיים [1] וגם סביבתיים [2] עשויים להיות קשורים מאוד להופעת ASD ולהתקדמותם בעוד שהמנגנונים שבבסיס ה- ASI שלו צפויים להיות רב-פקטוראליים [3-6]. על פי החשד, חשיפה אנושית לאלומיניום הייתה הגורם ל- ASD אך המסקנות היו מוטלות בספק [7-10]. עד כה רוב המחקרים השתמשו בשיער כמדד לחשיפה אנושית לאלומיניום בעוד שתכולת האלומיניום בדם ובשתן שימשה במידה הרבה יותר מוגבלת. חיסונים לילדים הכוללים תוספות על בסיס אלומיניום הם מדד עקיף לחשיפה של תינוקות לאלומיניום והשימוש הגובר שלהם היה קשור ישירות לשכיחות מוגברת של ASD [11]. מודלים של בעלי חיים של ASD ממשיכים לתמוך בחיבור עם אביזרים אלומיניום ובסיסים מאלומיניום המשמשים במיוחד לחיסונים לבני אדם [12]. נכון להיום, אין מחקרים על הימצאות אלומיניום ברקמת המוח של תורמים שמתו עם אבחנה של ASD. מדדנו את כמות האלומיניום הקיימת ברקמת המוח של נבדקים אוטיסטים וזיהינו את מיקום האלומיניום ברקמות אלה.

חומרים ושיטות
2.1. מדידת כמויות האלומיניום ברקמות המוח
אישור אתי התקבל יחד עם הרקמות של "בנק המוח באוקספורד" (בנק מוח אוקספורד - 15 / SC / 0639). דגימות נביחה השוות בערך גרם אחד של חומר קפוא מהאונות הזמניות, הפרונטליות, האזוריות והאביפיטליים וההיפוקמפוס (0,3 גרם בלבד), התקבלו מחמישה אנשים עם אבחנה של ASD שאושרו על ידי ADI-Rconfirmed (ראיון לאבחון אוטיזם) -בדיקה), 5 זכרים ונקבה אחת, בני 4 עד 1 שנה (טבלה 15). תכולת האלומיניום של בדים אלה נמדדה בשיטה מאוחדת ומאומתת לחלוטין [50] המתוארת כאן בקצרה.

תוצאות
3.1 תכולת אלומיניום ברקמות המוח
תכולת האלומיניום בכל הרקמות נעה בין 0,01 (הגבול לכימות) ל -22,11 מ"ג / גרם משקל חומר יבש. (שולחן 1). תכולת האלומיניום במוח בכללותה (n = 4 או 5 תלוי בזמינות רקמת ההיפוקמפוס) נעה בין 1,20 (1,06) מ"ג / גרם חומר יבש לאישה בת 44 (A1 ) עד 4,77 (4,79) מ"ג / גרם של הגבר בן 33 (A5). מדידות קודמות של אלומיניום במוח, כולל מחקרנו על 60 מוחיות [15], אפשרו לנו להגדיר בערך סוגים של תוכן אלומיניום החל בערכים הקטנים או שווים ל- 1,00 מ"ג / גרם כשפירים פתולוגית (להיפך של המושג 'נורמלי'). כ- 40% מהרקמות (24/59) היו בעלות תוכן אלומיניום שנחשב מדאיג פתולוגית (³2,00 מ"ג /) ואילו לכ 67% מרקמות אלה היה תוכן אלומיניום שנחשב כמשמעותי פתולוגית (³3,00 מ"ג / גרם. ). במוחם של כל 5 האנשים יש רקמה אחת לפחות עם תוכן אלומיניום בעל משמעות פתולוגית. במוחם של 4 הפרטים הייתה רקמה אחת לפחות עם תכולת אלומיניום הגדולה או שווה ל 5,00 מ"ג / גרם, ואילו 3 מהם היו לפחות רקמה אחת עם תכולת אלומיניום הגדולה או שווה ל 10,00 מ"ג / גרם (טבלה 1). תכולת האלומיניום הממוצעת (סטיית תקן בסוגריים) של 5 הפרטים לכל אונה הייתה 3,82 (5,42), 2,30 (2,00), 2,79 (4,05) ו- 3,82 ( 5,17) לאונות הקדמיות, העורפיות, הקדמיות, הזמניות והפריאטליות. לא היו הבדלים מובהקים סטטיסטית בתכולת האלומיניום בין 4 האונות.

3.2. פלואורסצנציה כתוצאה מאלומיניום ברקמות המוח
בדקנו קטעים סדרתיים במוח של 10 פרטים (3 נקבות ו -7 זכרים) שמתו עם אבחנת ASD ורשמו את נוכחות האלומיניום ברקמות אלה (טבלה S1). ההתרגשות של מתחם האלומיניום והלומוגליון מביאה פלואורסצנט כתום אופייני שנראה צהוב בהיר יותר ויותר ככל שעוצמת הקרינה עולה. אלומיניום, שזוהה כממצב תגובתי של לומוגליון, נרשם ברקמה אחת לפחות בכל 10 הפרטים. ההפרשה האוטומטית של הקטעים הסידוריים הסמוכים מייד אישרה כי הקרינה הלומוגליונית מעידה על הימצאות אלומיניום. מרבצי אלומיניום היו תכופים משמעותית יותר אצל גברים (129 מתוך 7 פרטים) מאשר אצל נקבות (21 מתוך 3 אנשים). אלומיניום נמצא גם בחומר לבן (62 משקעים) וגם בחומר אפור (88 משקעים). אצל נקבות מרבית מרבצי האלומיניום זוהו כחוץ תאים (15 מתוך 21) ואילו אצל גברים נמצא המצב ההפוך עם 80 מתוך 129 משקעים באזור התוך תאיים. הוספקו לנו רק 3 קטעים סדרתיים של כל רקמה ולכן לא הצלחנו לבצע כל מכתים שמטרתם לזהות את המורפולוגיה הכללית שפירושה שלא תמיד ניתן היה לקבוע איזה סוג תת תא מראה את הקרינה בגלל אלומיניום . תאי דם לבנים מונו-גרעיניים עמוסי אלומיניום, ככל הנראה לימפוציטים, זוהו במוח הקרום וכנראה נכנסו לרקמת המוח ממערכת הלימפה (איור. 10). ניתן לראות בבירור אלומיניום בתוך תאים או בצורה של מרבצי נקודה נפרדים, או כפלואורסצנטים צהובים עזים (איור. 1). האלומיניום אותר בתאים דלקתיים הקשורים לכלי הדם (איור. 2). באחד המקרים, מה שנראה כלימפוציט או מונוציט עמוס אלומיניום צוינו בתוך כלי דם מוקף בתאי דם אדומים ואילו לימפוציט סביר אחר שמראה פלואורסצנט צהוב עז נצפה בקרום ההרפתקני (איור. 2 ב). תאי גלייה, כולל חלקם הדומים לאלה של מיקרוגליה שהראו פלואורסצנציה בגלל נוכחות אלומיניום, נצפו לרוב ברקמת המוח בסביבות פיקדונות חוץ תאיים הצבעוניים על ידי אלומיניום (איורים 3 ו -4). משקעי אלומיניום בקוטר של כ -1 מ"מ נראו בבירור גם בגוף העגול וגם באמבוואידי של תאי הזוהר (למשל איור. 3 ב). אלומיניום תאיים זוהה בנוירונים ובתאים סבירים הדומים לאלה של הגליה, ולעתים קרובות בסביבה או באותו אתר בו ליפופוסין (איור. 5). הקרינה הסלקטיבית לאלומיניום עבדה בזיהוי האלומיניום באתרים חוץ תאיים ותאיים בתאים עצביים ולא תאי עצביים ובכל רקמות המוח שנחקרו (איורים 1-5). השיטה מזהה אלומיניום רק כפי שמעידים אזורים גדולים ברקמת המוח ללא כל פלואורסצנט אופייני המעיד על החיוביות לאלומיניום (איור.

אשכול

תכולת האלומיניום ברקמת המוח מתורמים שאובחנו כחולי ASD הייתה גבוהה ביותר (טבלה 1). בעוד שנמצאה שונות משמעותית בין רקמות שונות, אונות שונות ונבדקים שונים, תכולת האלומיניום הממוצעת עבור כל אונה (בקרב 5 אנשים) הייתה ברמות הגבוהות ביותר של כל המדידות הקודמות של תכולת האלומיניום מוח, כולל מקרים של הפרעות iatrogenic כגון אנליפאת דיאליזה [13,15, 16-19]. לכל ארבעת התורמים הגברים היה ריכוז אלומיניום מוחי גבוה יותר מאשר התורמת הנשית היחידה. אצל גברים אוטיסטים אלה רשמנו ערכי תכולת אלומיניום גבוהים ביותר במוח שנמדדו אי פעם ברקמות בריאות או חולות, כולל ערכים של 4 17,10 ו- 18,57 מ"ג / גרם חומר יבש. (שולחן 22,11). מה שמבדיל נתונים אלה מניתוחים אחרים של אלומיניום במוח במחלות אחרות הוא גילם של אנשים אוטיסטים. מדוע למשל, לילד בן 1 יהיה תכולת אלומיניום כה גבוהה ברקמת המוח שלו? אין נתונים דומים בספרות המדעית, הנתון הגבוה ביותר באופן דומה הוא זה של גבר בן 15 עם "צורה משפחתית" של מחלת אלצהיימר (FAD) [42]. מיקרוסקופ פלואורסצנטי סלקטיבי של אלומיניום סיפק אינדיקציות באתרי התצהיר אלומיניום ברקמות מוח אלה של נבדקים אוטיסטים (איורים 19-1).

אלומיניום נמצא גם בחומר לבן ואפור וגם באתרים החוץ תאיים וגם בסלולר. האחרונים היו נפוצים במיוחד ברקמות אלה של נבדקים אוטיסטים. תאים שנראו מורפולוגית לא נוירונאלית ועמוסים מאוד באלומיניום זוהו כתאים הקשורים לקרום המוח (איור 1), וסקולריזציה (איור 2) וכתאים של החומר האפור והחומר הלבן (איורים 3-5). חלק מהתאים הללו הופיעו גלייה (ככל הנראה אסטרוציטים) ואילו באחרים גרעינים מוארכים שהעניקו להם מראה של תאי מיקרוגליה [5]. האחרונים נראו לעיתים בסביבת מרבצי אלומיניום חוץ תאיים. זה מרמז שאלומיניום איכשהו חצה את מחסום הדם-מוח ונלקח מתא תאי, תא מיקרוגליה. מעניין לציין כי נוכחותם של מדי פעם של תאים דלקתיים עמוסי אלומיניום בכלי הדם והלפטומינגים פותחת אפשרות לכניסה שונה של אלומיניום למוח, או תוך תאית. עם זאת, כדי שתסריט שני זה יהיה תקף ניתן היה לצפות כי ייגרם סוג כלשהו של נזק תוך מוחי כדי לאפשר בריחה של לימפוציטים ומונוציטים מכלי הדם. הזיהוי שנעשה כאן של תאים לא עצביים כולל תאים דלקתיים, תאי גליה ותאי מיקרוגליה, כולם עמוסים באלומיניום, הוא תצפית יוצאת דופן עבור ASD. לדוגמה, מרבית מרבצי האלומיניום שזוהו ברקמת המוח ב"צורות המוכרות "של מחלת אלצהיימר היו חוץ תאיים וכמעט תמיד היו קשורים לחומר אפור [19].

האלומיניום הוא ציטוטוקסי [21] והקשר שלו (מוצג כאן) לתאים הדלקתיים של כלי הדם, קרום המוח ומערכת העצבים המרכזית בקושי יכול להיות שפיר. המיקרוגליה העמוסות בכבדות אלומיניום, למרות שהיא עשויה להישאר בת-קיימא, לפחות למשך זמן מה, תיפגע בהכרח ונחשבת כי תפקוד לקוי של המיקרוגליה מעורב באטיולוגיה של ASD [22], למשל בפגיעה בחוסר העלים הסינפטי [23] . בנוסף, העובדה כי נתונים אלה מצביעים על כך שהכניסה של אלומיניום למוח על ידי תאי מערכת החיסון המסתובבת בדם והלימפה מואצת אצל נבדקים אוטיסטים יכולה להתחיל להסביר את השאלה שהוצגה תחילה לגבי הסיבה לכך יש כל כך הרבה אלומיניום במוחו של ילד אוטיסט בן 15. מגבלה של המחקר שלנו היא המספר הקטן של המקרים הזמינים לניתוח והזמינות המוגבלת של רקמות. באשר לגורם האחרון, גישה לרקמות של 1 גרם רקמות קפואות ורק ל 3 חלקי סדרה של רקמות קבועות לכל אונה יכולים בדרך כלל להיחשב כמגבלה משמעותית. בהחלט אם לא היינו מזהים שום פיקדון משמעותי של אלומיניום במדגם כה קטן של רקמות (המסה הממוצעת של המוח משתנה בין 1.500 ל -2.000 גרם), אז תוצאה כזו תהיה חד משמעית. עם זאת, העובדה שמצאנו אלומיניום בכל דגימת רקמות בודדת, קפואה או קפואה, מרמזת מאוד על כך שאנשים שאובחנו עם ASD הם בעלי רמות גבוהות במיוחד של אלומיניום ברקמת המוח וכי אלומיניום זה קשור בולט לתאים שאינם עצביים כלולים. אלה של מיקרוגליה ומונוציטים דלקתיים אחרים.

מסקנות
ערכנו את המדידה הראשונה של תכולת האלומיניום ברקמת המוח אצל נושאים אוטיסטים והראנו שתכולת האלומיניום במוח גבוהה במיוחד. זיהינו אלומיניום ברקמת המוח הן באזורים החוץ תאיים והן בתאים (הן בנוירונים והן בתאים שאינם עצביים). נוכחות האלומיניום בתאים דלקתיים בקרום המוח, בווסקולריזציה, בחומר אפור-לבן היא תצפית יוצאת דופן ויכולה להדגים תפקיד גורם לאלומיניום באטיולוגיה של ASD.

PSUR 16: הכפלת מקרי המוות הצפויים
אם כל הילדים שקיבלו את המינון הראשון של החיסון מקבלים בסך הכל ארבע מנות והמינון האחרון מנוהל בשנה השנייה לחיים, ניתן להעריך שרבע (25%) מהמנות ניתנות לילדים גדולים יותר לשנה. זהו לוח החיסונים המומלץ בגרמניה. עם זאת, מדינות מסוימות, כמו איטליה, ממליצות על שלוש מנות בלבד, כולן בשנה הראשונה ואף אחת לא השנייה. בנוסף, לא כל הילדים מקבלים את כל המנות המומלצות. כך שלא סביר שישתמשו ב 20-25% מהמינונים בשנה השנייה. ב- PSUR 15, העריכו כי 90,6% מהמינונים שנמכרו שימשו בתינוקות מתחת לגיל שנה ו -9,4% לאנשים מעל גיל שנה. ב- PSUR 16 אומדן המינונים שהתקבלו בשנה השנייה יותר מכפיל את עצמו (מ- 9,4% ל -20%), ולכן הערכה של מקרי המוות הצפויים הוכפלה. למרות הכפלת מקרי המוות הצפויים, מספר מקרי המוות שנצפו בשנה השנייה היה גבוה מהצפוי בשלושת הימים הראשונים לאחר החיסון (טבלה 3, p36). אם ההערכה ב- PSUR 249 כי 15% מהמינונים משמשים בשנה השנייה נכונה, הדבר חל גם על PSUR 9,4, ולכן מקרי המוות שנצפו גבוהים יותר מהתמותה הצפויה בשבעת הימים הראשונים.

ניגודי אינטרסים של אינטרס
הכותבים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים

תודה

המחקר נתמך על ידי מימון של מכון לחקר הבטיחות הרפואית לילדים (CMSRI), קרן עמותה מבוססת וושינגטון הבירה, ארה"ב העוסקת במחקר

ריפרימינטי

A. Krishnan, R.Zhang, V. Yao, CLTheesfeld, AK Wong et al., תחזית רחבת גנום ואפיון פונקציונאלי של הבסיס הגנטי של הפרעת הספקטרום האוטיסטי, Nature Neuroscience 19 (2016) 1454-1462.
LA Sealey, BW יוז, AN Sriskanda, JR Guest, AD Gibson et al., גורמים סביבתיים בהתפתחות הפרעות בספקטרום האוטיזם, Environ. ב '88 (2016) 288-298.
R. Koyama, Y. Ikegaya, Microglia בפתוגנזה של הפרעות בספקטרום האוטיזם, Neurosci. מיל '100 (2015) 1-5.
Q. Li, JM. ג'ואו, ציר המיקרוביוטה-מוח-מוח ותפקידו הטיפולי הפוטנציאלי בהפרעה בספקטרום האוטיזם, Neuroscience 324 (2016) 131-139.
C. Kaur, G. Rathnasamy, EA. לינג, ביולוגיה של מיקרוגליה במוח המתפתח, J. Neuropathol Exp. Neurol. 76 (2017) 736-753.
M. Varghese, N. Keshav, S. Jacot-Descombes, T. Warda, B. Wicinski et al., הפרעת הספקטרום האוטיסטי: נוירופתולוגיה ומודלים של בעלי חיים, Acta Neuropathol. 134 (2017) 537 - 566.
H. Yasuda, Y. Yasuda, T. Tsutsui, הערכת ילדים אוטיסטים על ידי ניתוח מתכות, מדע מדעי 3 (2013) 1199.
FEB מוחמד, EA Zaky, AB El-Sayed, RM Elhossieny, SS Zahra et al., הערכת אלומיניום לשיער, עופרת וכספית במדגם של ילדים מצריים אוטיסטים: גורמי סיכון סביבתיים של מתכות כבדות באוטיזם, Neurol התנהגותי. (2015) אמנות 545674.
MH Rahbar, M. Samms-Vaughn, MR Pitcher, J. Bressler, M. Hessabi et al., תפקיד הגנים המטבוליים בריכוזי אלומיניום בדם של ילדים ג'מייקנים עם וללא הפרעה בספקטרום האוטיזם, Int. J. Environ. מילואים בריאות ציבורית 13 (2016) 1095.
AV Skalny, NV Simashkova, TP Klyushnik, AR Grabeklis, IV Radysh et al., ניתוח יסודות קורט שיער אצל ילדים עם הפרעות בספקטרום האוטיזם והפרעות בתקשורת, Trace Elem. Med. Biol. 177 (2017) 215-223.
L. Tomljenovic, CA Shaw, האם תוספי חיסון מאלומיניום תורמים לשכיחות הגוברת של אוטיזם ?, J. Inorg. Biochem. 105 (2011) 1489-1499.
CA Shaw, Y. Li, L. Tomljenovic, מתן אלומיניום לעכברים בילודים בכמויות הרלוונטיות לחיסון קשור בתוצאות נוירולוגיות ארוכות טווח, ג'יי אינג. Biochem. 128 (2013) 237-244
E. House, M. Esiri, G. Forster, P. Ince, C. Exley, אלומיניום, ברזל ונחושת ברקמות מוח אנושיות, שנתרמו למחקר התפקודי הקוגניטיבי של המועצה הרפואית והזדקנותם, Metallomics 4 (2012) 56-65.
M. Mold, H. Eriksson, P. Siesjö, A. Darabi, E. Shardlow, C. Exley, זיהוי חד משמעי של אביזר אלומיניום תוך תאי בשורה תאי THP-1 מונוציטית, Sci. Rep. 4 (2014) 6287.
A. Mirza, A. King, C. Troakes, C. Exley, זיהוי האלומיניום ברקמת מוח אנושית באמצעות לומוגאליון ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה, J. Alzh. דיס. 54 (2016) 1333-1338.
C. Exley, M. Esiri, אנגיופתיה מוחית קונגופילית מוחית חופפת את האלומיניום במוח תושב תושב קמפורד, קורנוול, בריטניה, ג'יי נורול. Neurosurg. פסיכיאטריה 77 (2006) 877-879.
ג. אקסלי, בית ER, אלומיניום במוח האדם, מונאץ '. Chem. 142 (2011) 357- 363.
ג. אקסלי, ט. וויקרס, אלומיניום מוחי מוגבה ומחלת אלצהיימר המוקדמת באדם שנחשף לאלומיניום תעסוקתי: דו"ח מקרה, ג'. מד. נציג 8 (2014) 41.
A. Mirza, A. King, C. Troakes, C. Exley, אלומיניום ברקמות מוח במחלת אלצהיימר משפחתית, J. Trace Elem. Med. Biol. 40 (2017) 30-36.
ר. שכטר, א 'מילר, ג. יובל, נ. רוזנצוויג, א. לונדון ואח', גיוס מקרופאגים M2 מועילים לחוט השדרה הפגוע מתוזמר על ידי מקלעת כלוריד מוחית מוחית, Immunity 38 (2013) 555-569.
ג. אקסלי, רעילות האלומיניום בבני אדם, Morphologie 100 (2016) 51-55.
MW Salter, B. Stevens, Microglia מופיע כשחקנים מרכזיים במחלות מוח, Nat. מד '23 (2017) 1018-1027.
U. Neniskyte, CT גרוס, גננים מתלהמים: גיזום סינפטי תלוי תאי גליה והפרעות עצביות, Nat. הכומר נוירושי. 18 (2017) 658-670.
גישה אלטרנטיבית לחיסונים משולבים: מתן תוך-עוריים של רכיבים מבודדים לבקרת אנתרקס, בוטוליזם, מגפה וזעזוע רעיל סטפילוקוקלי. (פורסם בתאריך כתב העת לטיפולים וחיסונים מבוססי חיסון. 2008 ספטמבר 3; 6: 5; המחברים Morefield GL, Tammariello RF et al; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18768085/)