وصلنا أخيرًا ، بعد ما يقرب من عامين ، نشر أول منشور في مراجعة الأقران لتحليلاتنا وسيتبعه العديد من المنشورات الأخرى.

نحاول هنا أن نلخص في هذه الصفحات الأولى ، بطريقة استدلالية وغير تقنية للغاية: ما تم نشره ، وما مدى صلاحيته وسبب أهميته في بحثنا عن اللقاحات. 

(من ناحية أخرى ، الصفحات من 3 إلى XNUMX مخصصة لدراسة فنية ، وترك تقييم المقال نفسه للعاملين في القطاع)

ما تم نشره على "F1000 Research" ¹ هو نتيجة الجزء الأول من العمل الذي قام به أحد المختبرات المسؤولة عن التحليلات نيابة عن جمعية Corvelva. تذكر - لأن أكثر من عامين قد مرت منذ بداية هذا العمل وأضيفت العديد من النتائج الأخرى إلى النتائج الأولية - أن كانت القضية الرئيسية الأولى التي وجدنا أنفسنا مضطرًا إلى التحقيق فيها هي الكمية غير الطبيعية من الحمض النووي البشري الموجودة في اللقاحات التي تم تحليلها. 

في كل من لقاح MPRV رباعي التكافؤ الذي تم تحليله ، تم العثور في البداية على كميات من 1 إلى 2,7 ميكروجرام / قارورة (حسب المنشور المعني) ، وهذا قادنا إلى الإبلاغ عن هذه النتيجة بشكل علني وفوري لأنه ببساطة ، لم يكن من المتوقع أن هذه الكمية من الحمض النووي كانت موجودة في اللقاح.

بصرف النظر عن الاعتبارات والاستنتاجات التي يصل إليها العمل ، والتي هي تقنية بحتة وبالتالي لا يمكن فهمها إلا لأولئك الذين يقومون بالبحث في مجال metagenomics ، ما لوحظ في الرسوم البيانية هو أنه تم العثور على عينتي اللقاح تحتوي على نسبة عالية من قراءات الحمض النووي البشري بالإضافة إلى تلك المتوقعة من جينوم فيروس جدري الماء (فيروس ألفا هربس البشري 3) ، فقط للكشف عن الأربعة، حيث تم عرض تحليل DNA-seq في المقالة.
ومع ذلك ، نود أن نؤكد أنه في وقت لاحق تم العثور على كميات من الحمض النووي وأكدت مع نفسه الطريقة التي تم التحقق منها الآن هنا كانت أعلى: ما يصل إلى 3,7 ميكروغرام لكل قارورة ، مما أدى إلى فرق كبير بين الدفعة والدفعة.
في الواقع ، تم الكشف في تقريرنا بتاريخ 22.12.2018 ² تم الإبلاغ عن نتائج لـ مزيد من التحليل بعد تلك التي نوقشت في المقالةثم تم تأكيدها من خلال التحليلات بين المختبرات التي لا تزال قيد النشر. 

لذلك ، فإن أكثر ما يهمنا في هذا المنشور هو أنه يتحقق من صحة الطريقة المستخدمة، يضع نقطة مهمة في المناقشات حول "نوع" التحليلات التي أجريت ، وبالتالي بشكل حاسم يؤكد كل العمل الذي تم القيام به في وقت لاحق مع طريقة NGS: رؤى حول نوع المادة الوراثية الواردة ، ووجود الفيروسات العرضية ، والغياب الكبير للفيروسات الموهنة التي يجب أن تكون موجودة بدلاً من ذلك والكمية بدلاً من السيطرة (أيضًا لأنها تختلف تمامًا من عينة إلى أخرى) من الحمض النووي البشري الموجود ، والسكان المتحولين ، والعاثية ، والحمض النووي من الأنواع الأخرى ، وتدريجيًا جميع النتائج التي تجدها ملخصة على موقعنا. ³

كل شيء ، من وجهة نظر المحتوى البيولوجي ، شجبناه في السنوات الأخيرة ، والإبلاغ الخاضع للنتائج إلى الهيئات الرقابية ، يأخذ دلالة علمية أكثر صلة (حتى لو كررناها مرة أخرى ، لم تكن مراجعات الأقران هي التي يجب أن تقلق لكن البيانات المقدمة خطيرة للغاية من حيث محتواها وآثارها المحتملة على صحة الإنسان). ومع ذلك ، بعد أن تم نشر الطريقة ، سنطالب بالحصول على الإجابات التي لم تصل بعد.

تؤكد هذه النتائج بشكل قاطع وجود الحمض النووي للجنين في لقاحات بريتيكس تيترا ، بكميات تتراوح بين الدفعات المختلفة ، مما يشير إلى ضعف مراقبة جودة هذه المنتجات الصيدلانية. 

نذكر أيضًا التقرير المتعلق بتسلسل جينوم MRC-5 بالكامل المنشور على موقع Corvelva على الويب بتاريخ 27.09.2019 ⁴ حيث يتضح التعديل العميق لهذا الحمض النووي أيضًا في الجينات المرتبطة بتطور أمراض الورم (يتم نشر بيانات أخرى).

الحمض النووي للجنين الملوث الموجود في جميع العينات التي تم تحليلها بكميات متغيرة (وبالتالي لا يمكن السيطرة عليها) أعلى بما يصل إلى 300 مرة من الحد الذي حددته EMA للحمض النووي المسرطن (10 نانوغرام / جرعة ، المقابلة للحمض النووي الموجود في حوالي 1000 خلية سرطانية ، تم الحصول عليها على أساس حساب إحصائي ، في حين أن الحد الوقائي هو 100 جزء من الغرام / جرعة) والذي يجب تطبيقه بالضرورة أيضًا على DNA الجنين الذي يلوث حتمًا Priorix Tetra.

ويترتب على ذلك أن هذا اللقاح يجب اعتباره معيبًا ويمكن أن يكون خطيرًا على صحة الإنسان ، وخاصةً لدى الأطفال الذين يكونون أكثر عرضة للتلف الوراثي والمناعة الذاتية بسبب عدم نضج نظم الإيواء.

كما هو متوقع ، ما يلي هو أكثر "تقنيًا" ويصعب فهمه لغير المتخصصين ، لذلك قررنا أيضًا ، من أجل الشفافية ، أن نرفق بهذه الوثيقة أيضًا "EMA - NGS Dossier مناقشة النتائج التي تم الحصول عليها من مسح جودة اللقاح". كان علينا فقط استقراء الجزء المفصح عنه ، أكثر من 50 صفحة من الملفات مقارنة بـ 200 من NGS ، حيث يجب أن تظل معظم المعلومات الواردة والمسجلة لدى الهيئات التنظيمية سرية. لا يتطلب قانون العلم القاسي أن يتم نشر البيانات في مجلة إلا إذا لم يتم نشرها ونحن ، بعد وجود العديد من المنشورات الأخرى الجارية ، لا نريد أن نعرضها للخطر.

 وأخيرًا ، لتجنب أي سوء فهم ، نود أن نذكر من المنشور الجزء من "إعلان التمويل": 

“تم تمويل تسلسل metagenomic B1 و B2 من قبل Corvelva (جمعية غير ربحية ، فينيتو ، إيطاليا) ، كجزء من عقد خدمة مع المختبر. لم تشارك أي مساهمات أخرى في دعم العمل. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو في جمع البيانات وتحليلها أو في قرار النشر أو في تحضير المخطوطة.

---

المرفقات:

• المنشور - هل تريد لي؟ تأثير تخفيض التغطية على دراسات تسلسل بندقية metagenome
• CORVELVA-موضوع NGS-EMA-ITA
• PDF - أول نشر لمراجعة النظراء حول لقاحات MPRV (Priorix Tetra)

في المقال "هل تريدني؟ تأثير تخفيض التغطية على دراسات تسلسل بندقية ميتاجينوم "

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/

يتناول المؤلفون السؤال التقني والمنهجي حول ما إذا كان من الممكن استخدام نهج ميتاجينوميات ضخمة موازية مع تغطية قراءة منخفضة لوصف المصفوفات البيولوجية المعقدة. يتم حساب تقديرات التنوع ووفرة الأنواع والقدرة على إعادة بناء ميتاجينوم de novo من حيث الطول والاكتمال ، من أجل فهم مقدار الانخفاض في عمق التسلسل ، المتنوع عن طريق أخذ عينات فرعية عشوائيًا لقراءات التسلسل ، يمكن تظهر النتائج أن مؤشرات التنوع للمجتمعات المعقدة بدائية النواة وحقيقية النواة والفيروسية يمكن تقديرها بدقة بـ 500.000 قراءة أو أقل ، على الرغم من أن العينات المعقدة بشكل خاص قد تتطلب 1.000.000 قراءة. على العكس من ذلك ، فإن المشروع الذي يتضمن إعادة بناء الميتاجينوم والجينات التي يحتويها يتطلب أكثر من مليون قراءة.

من بين المصفوفات المعقدة المختلفة والمختلفة للغاية التي خضعت لتحليل ميتاجينومي ضخم ، تم تضمين دواء بيولوجي ، وهما مجموعتان مختلفتان من لقاح MPRV الموهن الحي المستخدم للتحصين ضد الحصبة والنكاف والحصبة الألمانية وجدري الماء عند الأطفال. تم استخراج الحمض النووي من اللقاحات ، ثم تم بناء مكتبات الجينوم باستخدام البروتوكولات التجارية القياسية وتم تنفيذ التسلسل الضخم باستخدام تقنية Illumina.

بصرف النظر عن الاعتبارات والاستنتاجات التي يصل إليها العمل ، والتي هي تقنية بحتة وبالتالي لا يمكن فهمها إلا لأولئك الذين يقومون بالبحث في مجال metagenomics ، ما هو ملاحظ في المخططات الدائرية الواردة في "البيانات الموسعة" (https://osf.io/wq395/ عينات B1 و B2) هو أن عينتي اللقاح تم العثور عليها لاحتوائهما على نسبة عالية من قراءات الحمض النووي البشري بالإضافة إلى تلك المتوقعة من جينوم فيروس الحماق (فيروس الهربس البشري 3) ، وهو الوحيد الذي يمكن اكتشافه من بين الأربعة ، الموجود في المقال تم تقديم تحليل نوع DNA-seq. 

71 ٪ من القراءات في دفعة واحدة و 88 ٪ في الأخرى من أصل بشري ، من المفترض أنها مشتقة من خط الخلية من أصل جنيني MRC-5 (تذكر أن التحليلات اللاحقة قد أكدت أن الخط هو MRC5) التي تنمو فيها فيروسات الحصبة الألمانية وجدري الماء المضعف أثناء تحضير اللقاح. علاوة على ذلك ، كما حدث في مجموعات مختلفة من نفس لقاح MPRV الذي تم اختباره بواسطة Corvelva بين عامي 2017 و 2019 ، فإن كمية الحمض النووي المستخرج من ترتيب الميكروجرام. 

في كميات اللقاح التي تم اختبارها باستخدام نفس البروتوكولات والتكنولوجيا المذكورة في مواد وطرق المقالة ، تراوحت الكميات المكتشفة بين 1 وما يقرب من 3 ميكروجرامات لكل قارورة ، وتتراوح الكميات بين دفعة وأخرى ، ولكنها دائمًا مهمة

B1 https://osf.io/86mbn/

B2 https://osf.io/dxayz/

في التقرير الذي كشفت عنه Corvelva في 22.12.2018 تم الإبلاغ عن النتائج التالية مزيد من التحليل بعد تلك التي نوقشت في المقالة، ثم تم تأكيده أيضًا من خلال التحليل بين المختبرات الذي لا يزال قيد النشر: 

بريوريكس تيترا الكثير. A71CB205A (يونيو 2018) - تحليل الحمض النووي

بريوريكس تيترا الكثير. A71CB256A (ديسمبر 2018) - تحليل الحمض النووي

تحليل الحمض النووي

قياس تركيز الحمض النووي مع جهاز قياس الفلورة QuBit أظهر أن الكثير A71CB205A يحتوي على كمية من 1.7 ميكروغرام من الحمض النووي البشري المجاميع لكل جرعة 0.5 مل ، محسوبة على النحو التالي: 9.41ng / ميكرولتر (التركيز المحدد عند QuBit) × 45 (حجم إعادة التعليق النهائي للحمض النووي بعد الاستخراج ، معبرًا عنه بالميكروليتات) × 4 (حجم البدء الذي يخضع لإجراء الاستخراج هو ¼ حجم الجرعة الموجودة في القارورة بأكملها يساوي 0.5 مل).

قياس تركيز الحمض النووي مع جهاز قياس الفلورة QuBit أظهر أن الكثير A71CB256A يحتوي على كمية من gDNA من إجمالي 3.7 ميكروغرام لكل جرعة 0.5 مل، محسوبة على النحو التالي: 40.8 نانوغرام / ميكرولتر (التركيز المحدد عند QuBit) × 55 (حجم إعادة التعليق النهائي للحمض النووي بعد الاستخلاص المعبر عنه بالميكروليتات) × 5/3 (حجم البدء الذي يخضع لإجراء الاستخراج هو 300 ميكرولتر من 500 ميكرولتر من التعليق).

يحتوي الحمض النووي البشري الموجود في هذه المجموعة على نسبة نسبية تبلغ حوالي 8 إلى 1 مقارنةً بالحمض النووي لجدري الماء (انظر النتائج التالية لتصنيف شظايا DNA-seq ، حيث يتبين أن 88 ٪ من إجمالي أجزاء الحمض النووي المتسلسلة هي الأصل البشري ، و 11 ٪ من جينوم فيروس الحماق). بالنظر إلى أن NGS هي تقنية كمية ، فإن القياس الكمي الفلوري لإجمالي الحمض النووي المستخرج من اللقاح (على سبيل المثال. A71CB256A = 3,7 ميكروغرام لكل جرعة) ، المرتبط بالنظر في الكمي النسبي الوارد أعلاه (8: 1) ، يسمح لنا لقول أن الحمض النووي البشري يمكن أن يكون موجودًا 2,9 ميكروغرام لكل جرعةمقارنة بحوالي 740 نانوجرام من الحمض النووي لجدري الماء. ومن المعقول أن قد يكون جزء على الأقل من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي الذي يتم رؤيته على الهلام عبارة عن الحمض النووي البشري عالي الوزن الجزيئي.

تحليل الحمض النووي الريبي

كمية RNA وجدت في قارورة دفعة اللقاح A71CB256A تقريبا 200ng.

يشير RIN يساوي 8 إلى RNA بجودة ممتازة و RNA حقيقي النواة ، حيث أن كلا من قمم 18S و 28S نموذجية من RNA حقيقية النواة موجودة.

الإجابات على أسئلتنا المحالة إلى الهيئات التنظيمية بمرور الوقت لها أهمية كبيرة. في الوقت الحالي ، لم تجب الوكالات بعد على الأسئلة المتعلقة بنتائج التحليلات الكاملة التي تم تسليمها إلى EMA و AIFA.

مقتطفات من إجابة ema على سؤالنا بشأن سلامة بقايا mrc-5 في لقاح tetra Priorix (مرجع طلب EMA ask-43967 3 أغسطس 2018) - "بناءً على المعلومات المنشورة ، تحتوي Priorix Tetra على سلالات فيروسية يتم إنتاجها بشكل منفصل في خلايا جنين الدجاج (النكاف والحصبة) أو في الخلايا ثنائية الصبغة البشرية MRC-5 (الحصبة الألمانية والجدري). تتضمن خطوط الخلايا المستخدمة لـ Priorix Tetra خطوط الخلايا ثنائية الصبغة البشرية التي لا يمكن تقسيمها باستمرار. لاحظ أنه ، وفقًا لدستور الأدوية الأوروبي ، فإن خطوط الخلايا ثنائية الخلية MRC-5 ليست مسببة للأورام ، كما هو موضح من خلال عقود من الاستخدام والتحكم ، وبالتالي لا يتم تطبيق الحد الأقصى للحمض النووي لخلايا MRC-5 "

حتى الآن ، لم يتم تقديم أي دليل (لا من حيث شهادات التحليل على جودة المنتج ، ولا من المؤلفات المرجعية العلمية لـ EMA) لهذه الضوابط التي تضمن أنه من المناسب عدم تطبيق حد أقصى.

في إرشادات إدارة الغذاء والدواء "إرشادات الصناعة: توصيف وتأهيل ركائز الخلية والمواد البيولوجية الأخرى المستخدمة في إنتاج اللقاحات الفيروسية لمؤشرات الأمراض المعدية" ⁶ يقال أن:

• يجب أن تبقى سلالة من الخلايا ثنائية الصبغية ثنائية الصبغة دائمًا. إذا كانت هذه الخصائص غير مستقرة ، فمن الضروري إثبات أن عدم الاستقرار لا يؤثر سلبًا على إنتاج أو مطابقة المنتج.
• بالنسبة لسلالات الخلايا ثنائية الصبغة البشرية المستخدمة على نطاق واسع ، مثل خلايا MRC-5 و WI-38 ، قد لا يكون قياس الحمض النووي المتبقي ضروريًا لأننا لا نعتبر الحمض النووي المتبقي لهذه الخلايا ثنائية الصبغيات البشرية مصدر قلق للسلامة  
• يجب أن يكون الحمض النووي المتبقي محدودًا للخلايا المستمرة غير الورمية ، مثل خلايا VERO منخفضة التمرير ، وأقل من 10 نانوغرام / جرعة للتلقيح بالحقن على النحو الموصى به من قبل منظمة الصحة العالمية

وفي المبادئ التوجيهية لمنظمة الصحة العالمية "الملحق 3 - توصيات لتقييم مزارع الخلايا الحيوانية كركائز لتصنيع الأدوية البيولوجية ولتوصيف البنوك الخلوية. استبدال الملحق 1 من سلسلة التقارير التقنية لمنظمة الصحة العالمية ، ن. 878 " ⁷ نضيف: (...) تراكمت خبرة كبيرة في علم الوراثة الخلوية WI-38 و MRC-5 منذ الستينيات

ولدعم هذه التجربة ، تم سرد المقالات التالية:

• جاكوبس جي بي. تم تحديث النتائج في علم كاريولوجيا السلالات الخلوية WI-38 و MRC-5 و MRC-9. التطورات في التقييس البيولوجي ، 1976 ، 37: 155–156.
• جاكوبس جي بي. وآخرون. مبادئ توجيهية لقبول الخلايا ثنائية الصبغيات البشرية المنتشرة بشكل متسلسل وإدارتها واختبارها لإنتاج لقاحات الفيروسات الحية لاستخدامها في الإنسان. مجلة التوحيد البيولوجي ، 1981 ، 9: 331–342.
• Petricciani JC et al. معايير علم الكاريولوجي لخط الخلية المزدوجة الريسوس DBS-FRhL-2. مجلة التوحيد البيولوجي ، 1976 ، 4: 43-49.
• شولماير وآخرون. تحليل عالي الدقة وتكثيف تفاضلي في الكروموسومات البشرية ذات النطاق RBA. علم الوراثة البشرية ، 1981 ، 59: 187-193.
• رون م. إعداد الكروموسوم وتقنيات ربط عالية الدقة: مراجعة. مجلة علوم الألبان ، 1989 ، 72: 1363-1377.

يمكن ملاحظة أن المؤلفات المرجعية ، للحفاظ على أن الخلايا ثنائية الصبغة المستخدمة لإنتاج اللقاحات آمنة من وجهة نظر الاستقرار الجيني ، عفا عليها الزمن. منذ 40 عامًا ، تم العثور على أول شذوذ وراثي ، يُعتبر ضئيلًا بالنسبة لسلامة اللقاحات ، ومن ما ورد في إرشادات منظمة الصحة العالمية ، ومنذ ذلك الحين لم يتم إجراء تحديثات على تقنيات التسلسل الجديدة ، ولا سيما في NGS ، والتي تعد اقتصادية أيضًا وسريع ، مع ما يترتب على ذلك من لقاحات تدار على مدى عقود ، سمحت الوكالات بوجود الحمض النووي المعدل وراثيًا بشكل متزايد بكميات غير خاضعة للرقابة. في هذا الصدد ، انظر التقرير حول تسلسل جينوم MRC-5 بالكامل المنشور على موقع Corvelva على الويب في 27.09.2019. ⁸ حيث يتضح التعديل العميق لهذا الحمض النووي أيضًا في الجينات المرتبطة بتطور أمراض الورم. (يتم نشر البيانات)

تم الإبلاغ عن مقتطف من الرسالة التي كتبها د. ت. ديشر ، الخبير العالمي في استخدام الخلايا الجذعية للأغراض العلاجية والعلاج الجيني ، والذي يسلط الضوء على القلق من المخاطر المرتبطة باستخدام اللقاحات الملوثة ببقايا خلايا الجنين البشرية: 

د. ت. ديشر (رسالة إلى الحكام - 8 أبريل 2019) ⁹ - (...) حقن أطفالنا بتلوث الحمض النووي للجنين البشري ينطوي على خطر التسبب في مرضين راسخين:

• الطفرات الجينية: يتم دمج الحمض النووي للجنين البشري في الحمض النووي للطفل مما يسبب طفرات. أظهر العلاج الجيني باستخدام إعادة التركيب البسيط للشظايا الصغيرة أن الكميات الصغيرة مثل 1,9 نانوغرام / مل من شظايا الحمض النووي تؤدي إلى إدخال الخلايا الجذعية في الجينوم في 100 ٪ من الفئران المحقونة. تصل مستويات شظايا الحمض النووي للأجنة البشرية في أطفالنا بعد التطعيم بلقاحات MMR أو VARIVAX (جدري الماء) أو التهاب الكبد A إلى مستويات أعلى من 1,9 نانوغرام / مل.
• مرض المناعة الذاتية: الجنين البشري DNA يحفز رد فعل الجهاز المناعي لمهاجمة جسم الطفل.

تعزز نتائجنا بشكل كبير الملاحظات التجريبية للدكتور ديشر وقبل كل شيء حقيقة أن الحمض النووي للجنين الملوث الموجود في جميع العينات التي تم تحليلها بكميات متغيرة (وبالتالي غير خاضعة للرقابة) هو حتى 300 ضعف حد EMA للحمض النووي المسرطن (10 نانوغرام / جرعة ، المقابلة للحمض النووي الموجود في حوالي 1000 خلية سرطانية ، تم الحصول عليها على أساس حساب إحصائي ، في حين أن الحد الوقائي هو 100 جزء من الغرام / جرعة) يجب تطبيقه بالضرورة أيضًا على الحمض النووي للجنين الذي لا بد من تلويث البداهة تيترا.

ويترتب على ذلك أن هذا اللقاح يجب اعتباره معيبًا ويمكن أن يكون خطيرًا على صحة الإنسان ، وخاصةً لدى الأطفال الذين يكونون أكثر عرضة للتلف الوراثي والمناعة الذاتية بسبب عدم نضج نظم الإيواء.

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7059852/
2. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
3. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate.html
   https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate-en.html
4. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
5. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/analisi-metagenomiche-su-priorix-tetra.html
6. https://www.federalregister.gov/documents/2010/03/04/2010-4553/guidance-for-industry-characterization-and-qualification-of-cell-substrates-and-other-biological
7. https://www.who.int/biologicals/vaccines/TRS_978_Annex_3.pdf
8. https://www.corvelva.it/speciale-corvelva/vaccinegate/sequenziamento-del-genoma-completo-di-mrc-5-contenuto-in-priorix-tetra.html
9. https://www.corvelva.it/approfondimenti/notizie/mondo/lettera-aperta-ai-legislatori-sul-dna-fetale-nei-vaccini-theresa-deisher.html