Korte presentatie van de resultaten

We presenteren vandaag een verdere zeer belangrijke studie over de genomische sequentiebepaling van de cellijn die wordt aangetroffen in het quadrivalente vaccin MPRV (mazelen, rubella, bof en waterpokken) Priorix Tetra en die van de MRC-5-cellijn (die wordt gebruikt bij de ontwikkeling van de vaccin zelf).

Een samenvatting van de eerder gepubliceerde rapporten: 

1. we hebben eerst gedemonstreerd hoe de hoeveelheid DNA aanwezig is in het bovengenoemde vaccin was ruim boven het toegestane;  
2. we hebben toen geverifieerd dat de cellijn dat is eigenlijk de verklaarde MRC-5; 
3. we gingen vervolgens verder genoomsequentiebepaling van de cellijn die rechtstreeks uit het vaccin is gehaald, met de nadruk op zeer zware mutaties die de mogelijkheid van ernstige gezondheidsrisico's met zich meebrengen bij het gebruik van dit vaccin.

Wat we hier presenteren, is precies het vergelijkingswerk tussen de twee genomen: wat we echt vonden in het vaccin en dat van de MRC-5 gekocht uit de ATCC-database.

Het resultaat is dat de twee lijnen belangrijke verschillen vertonen vanuit het oogpunt van genetische stabiliteit. In het bijzonder lijkt het vaccingenoom sterk veranderd te zijn in vergelijking met dat van de cellijn die in 1966 is afgezet.

Dit betekent dat de producenten, in dit geval van de Priorix-tetra, de cellijn hebben gekocht in optimale omstandigheden vanuit het oogpunt van genetische stabiliteit en bij continu gebruik in de loop van de tijd voor de productie vaccins met menselijk genetisch materiaal geleidelijk op de markt hebben gebracht steeds meer aangepast en gevaarlijk voor de gezondheid van de gevaccineerde. 

Aangezien regelgevende instanties geen periodieke controle van de genetische stabiliteit van foetale lijnen vereisen en zelfs geen minimumveiligheidsdrempel vaststellen, kunnen we afleiden dat een fundamentele vereiste voor de kwaliteit en veiligheid van de vaccins die zijn verkregen uit menselijke cellijnen, dat wil zeggen de noodzaak om te verifiëren dat ze geen potentieel gevaarlijke mutaties en herschikkingen verwerven en om de eliminatie van verwerkingsresiduen van genetisch materiaal te garanderen, indien aanwezig.

Het is niet aan ons om vast te stellen welk deel van het productie- of conserveringsproces de kwaliteit en veiligheid van het product kan beïnvloeden, maar wat we vandaag kunnen getuigen door dit rapport te publiceren, is dat de controleorganen de resultaten die onze analyses hebben benadrukt, dringend grondig moeten onderzoeken. in deze twee jaar de aandacht vestigen op het eindproduct, verkocht en toegediend en niet alleen op de individuele geautoriseerde "ingrediënten".

Bedenk nogmaals dat deze producten deel uitmaken van de Italiaanse vaccinatiekalender en momenteel verplicht worden toegediend aan de pediatrische bevolking van ons land, evenals aan andere Europese landen en in het algemeen over de hele wereld.

De controleorganen hebben een enorme verantwoordelijkheid voor veiligheid die momenteel in woorden wordt aangekondigd, maar die in feite blijkbaar, en zoals blijkt uit onze analyses, niet kan worden gegarandeerd en inderdaad duidelijk wordt genegeerd.

Circulaire visualisatie van genomen (circusplot)

Een grafische weergave van de twee genomen genaamd 'circosplot' wordt hieronder getoond.

Betekenis van de verschillende concentrische cirkels

1. De buitenste cirkel (de eerste cirkel) is het chromosoomnummer.
2. De tweede ring (blauw) vertegenwoordigt de dekking van lezingen in histogramstijl. Elk histogram is de gemiddelde dekking van een gebied van 0,5 Mbp.
3. De derde ring (zwart) vertegenwoordigt de dichtheid van de INDEL's in een 'dispersiegrafiek'-stijl. Elk zwart punt wordt berekend als het aantal INDEL's (kleine invoegingen / verwijderingen) in een bereik van 1 Mbp.
4. De vierde ring (groen) vertegenwoordigt de dichtheid snp in een 'dispersiegrafiek'-stijl. Elke groene stip wordt berekend als het aantal SNP's (enkelvoudige nucleotidevarianten) in een bereik van 1 Mbp.
5. De vijfde ring vertegenwoordigt het aandeel homozygositeit (oranje) en heterozygositeit (grijs) SNP in histogramstijl. Elk histogram wordt berekend op basis van een gebied van 1 Mbp.
6. De zesde ring vertegenwoordigt de gevolgtrekking van CNV (varianten in aantal exemplaren). Rood betekent het verkrijgen van stukjes DNA en groen betekent verlies.
7. De meest centrale ring vertegenwoordigt de gevolgtrekking van SV (Structural Variants) in de exonische en splicinggebieden. TUSSEN (oranje, translocaties), INS (groen, invoegingen), DEL (verwijderingen, grijs), DUP (duplicaties, roze) en INV (inversies, blauw).

conclusies

De twee genomen vertonen belangrijke verschillen. In het bijzonder blijkt het vaccingenoom sterk te veranderen in vergelijking met dat van de cellijn die in 1966 is gedeponeerd. Het moet gezegd worden dat we niet de mogelijkheid hadden om de cellijn die door GlaxoSmithKline wordt gebruikt voor de productie van het Priorix Tetra-vaccin, maar die van de voorraad, te sequencen. origineel. Farmaceutische bedrijven die cellijnen gebruiken voor de productie van medicijnen en vaccins hebben hun MRC-5-lijn, maar dit verandert niets aan onze vermoedens, dat wil zeggen het feit dat genetische stabiliteitscontrole niet periodiek vereist is en dit is naar onze mening zeer ernstig vooral omdat het onbeperkt aanwezig mag zijn.

Download link: CORVELVA-vergelijking-humaan-genoom-Priorix-Tetra-en-lijn-MRC-5.pdf

Vergelijking tussen menselijk genoom in Priorix Tetra en in de MRC-5-cellijn (ATCC-standaard MRC-5 ATCC® CCL-171 ™)

De aanwezigheid van het rubella-virus werd aangetoond door het sequencen van een extreem diepe RNA-seq-bibliotheek (ongeveer 260 miljoen geproduceerde Illumina-sequenties). 114 van de 260 miljoen sequenties werden gedetecteerd, gelijk aan 0.00004% van de totale sequentie. De rubella-genoomsequenties werden vervolgens handmatig bevestigd met de BLAST-software (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). De gesequentieerde bibliotheek op een lagere diepte (ongeveer 12 miljoen Illumina-gepaarde sequenties, gelijk aan 6 miljoen gesequentieerde bibliotheekfragmenten) had de aanwezigheid van ELKE reads die aan rubella in deze partij kunnen worden toegeschreven, niet gedetecteerd.

De sequenties van de andere virussen in het vaccin (waterpokken, mazelen en bof) werden ook op dezelfde handmatige manier gevalideerd, wat bevestigde dat ze correct waren toegewezen.

Introductie

De nieuwe generatie sequencers zijn instrumenten bij uitstek geworden voor diepgaande analyses op het gebied van biologie en geneeskunde, vooral de precisie. Deze tools maken een nieuwe en meer globale benadering mogelijk van een reeks toepassingen zoals de novo sequencing, metagenomics, epigenomics, transcriptome sequencing en genome re-sequencing.

Deze laatste toepassing (re-sequencing) is zeer wijdverbreid in de mens zowel voor onderzoek als diagnostische doeleinden en bestaat uit de sequentiebepaling met NGS-technologie (Next Generation Sequencing) van een volledig individueel genoom om enkele nucleotidemutaties (SNP, uitspraak 'snip' in kaart te brengen) '), inserties en deleties van min of meer lange sequenties kwamen voor op bepaalde posities van het genoom en variaties in het aantal kopieën van delen van genoom / genen (CNV, Copy Number Variants).

De sequentiebepalingsprocedure vereist dat het DNA van een individu mechanisch wordt gebroken in kleine fragmenten (400-500 basenparen) en dat fragmenten van kunstmatige DNA-kanalen die adapters worden genoemd, aan de fragmenten worden gebonden, waardoor de fragmenten van menselijk DNA aan een glazen oppervlak waarop de bases worden afgelezen (A, C, G, T). De DNA-basen worden afgelezen door chemische reacties op te nemen van nucleotiden die zijn gelabeld met fluorescerende moleculen. De miljoenen sequenties (gelezen) verkregen door sequentiebepaling op het glasoppervlak worden vervolgens in kaart gebracht op het menselijke referentiegenoom met geschikte software en vervolgens worden alle varianten die aanwezig zijn in het geanalyseerde genoom vergeleken met de referentie geïdentificeerd.

Deze zelfde procedure werd uitgevoerd op het menselijke genoom dat aanwezig is in de Priorix Tetra-partij. n. A71CB256A en op het DNA geëxtraheerd uit de MRC-5-cellijn, gedeponeerd in 1966 bij ATCC (MRC-5 ATCC® CCL-171 ™).

ATCC is 's werelds toonaangevende organisatie van bronnen en standaarden voor biologische materialen en heeft als missie de verwerving, authenticatie, productie, opslag, ontwikkeling en distributie van referentiemicro-organismen, cellijnen en andere standaard biologische materialen. Het werd opgericht in 1925, toen een commissie van wetenschappers de noodzaak inzag van een gecentraliseerde verzameling biologische materialen die wetenschappers over de hele wereld van dienst zouden kunnen zijn.

De MRC-5-cellijn is afgeleid van normaal longweefsel van een 14 weken oude mannelijke foetus en werd in september 1966 door JP Jacobs in ATCC gedeponeerd. Deze cellen zouden 42 tot 46 populaties kunnen verdubbelen vóór initiatie. van veroudering. Het referentieartikel voor deze cellijn dateert van 1970: https://www.nature.com/articles/227168a0

resultaten

Zoals eerder aangetoond, is het menselijke DNA aanwezig in de Priorix Tetra-partij. n. A71CB256A (aangegeven in de volgende grafieken als monster ID12051PT) is een compleet individueel genoom, dat wil zeggen dat er genomisch DNA is van alle chromosomen van een mannelijk individu. De dekkingsgrafieken (gemiddelde diepte = gemiddelde dekking) van de 22 menselijke chromosomen en de X- en Y-chromosomen worden hieronder weergegeven, voor het vaccin (afbeelding hierboven) en de cellijn MRC5 (afbeelding hieronder).

De resultaten van de analyse van de verschillende soorten varianten worden hieronder weergegeven.

Varianten met één nucleotide (SNP) en korte inserties / deleties (InDels)

De varianten van enkelvoudige DNA-basen (SNP, uitgesproken als 'knipsel') zijn polymorfismen, dat wil zeggen variaties van het genetische materiaal, gedragen door een enkel nucleotide. De 'InDels' daarentegen zijn kleine inserties en deleties van minder dan 50 bp lang en vormen een andere klasse van genomische varianten in het menselijk genoom.

SNP (single nucleotide varianten) - ID12051PT

SNP (single nucleotide varianten) - MRC-5

INDEL's (kleine invoegingen / verwijderingen) - ID12051PT

INDEL's (kleine invoegingen / verwijderingen) - MRC-5 

CNV (kopie nummer varianten) en SV (structurele varianten)

Varianten in aantal kopieën (CNV) zijn genomische varianten vanwege variaties in het aantal kopieën van relatief grote fragmenten (langer dan 50 bp) tussen individuele genomen. Er zijn twee soorten CNV: 'gain' type (copy gain) en 'loss' type (verlies van kopieën).

Structurele varianten (SV) zijn genomische varianten met relatief grote afmetingen (> 50 bp), inclusief deleties, duplicaties, inserties, inversies en translocaties.

CNV (variaties in aantal exemplaren)

SV (structurele varianten)

Circulaire visualisatie van genomen (circusplot)

Een grafische weergave van de twee genomen genaamd 'circosplot' wordt hieronder getoond.

Betekenis van de verschillende concentrische cirkels

1. De buitenste cirkel (de eerste cirkel) is het chromosoomnummer.
2. De tweede ring (blauw) vertegenwoordigt de dekking van lezingen in histogramstijl. Elk histogram is de gemiddelde dekking van een gebied van 0,5 Mbp.
3. De derde ring (zwart) vertegenwoordigt de dichtheid van de INDEL's in een 'dispersiegrafiek'-stijl. Elk zwart punt wordt berekend als het aantal INDEL's (kleine invoegingen / verwijderingen) in een bereik van 1 Mbp.
4. De vierde ring (groen) vertegenwoordigt de dichtheid snp in een 'dispersiegrafiek'-stijl. Elke groene stip wordt berekend als het aantal SNP's (enkelvoudige nucleotidevarianten) in een bereik van 1 Mbp.
5. De vijfde ring vertegenwoordigt het aandeel homozygositeit (oranje) en heterozygositeit (grijs) SNP in histogramstijl. Elk histogram wordt berekend op basis van een gebied van 1 Mbp.
6. De zesde ring vertegenwoordigt de gevolgtrekking van CNV (varianten in aantal exemplaren). Rood betekent het verkrijgen van stukjes DNA en groen betekent verlies.
7. De meest centrale ring vertegenwoordigt de gevolgtrekking van SV (Structural Variants) in de exonische en splicinggebieden. TUSSEN (oranje, translocaties), INS (groen, invoegingen), DEL (verwijderingen, grijs), DUP (duplicaties, roze) en INV (inversies, blauw).

conclusies

De twee genomen vertonen belangrijke verschillen. In het bijzonder blijkt het vaccingenoom sterk te veranderen in vergelijking met dat van de cellijn die in 1966 is gedeponeerd. Het moet gezegd worden dat we niet de mogelijkheid hadden om de cellijn die door GlaxoSmithKline wordt gebruikt voor de productie van het Priorix Tetra-vaccin, maar die van de voorraad, te sequencen. origineel. Farmaceutische bedrijven die cellijnen gebruiken voor de productie van medicijnen en vaccins hebben hun MRC-5-lijn, maar dit verandert niets aan onze vermoedens, dat wil zeggen het feit dat genetische stabiliteitscontrole niet periodiek vereist is en dit is naar onze mening zeer ernstig vooral omdat het onbeperkt aanwezig mag zijn.